固定化トロポミオシンキナーゼ受容体Bと相互作用する特殊な植物代謝産物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラム
Summary
プロトコールは、機能的な膜貫通型トロポミオシンキナーゼ受容体Bタンパク質を含む固定化細胞膜断片を用いた細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの調製を記載しています。これらの受容体と相互作用し、複雑な天然混合物中に存在する特殊な植物代謝産物の同定におけるCMACカラムの使用についても説明します。
Abstract
植物、真菌、細菌、海洋無脊椎動物によって合成された化学物質は、新薬のヒットとリードの豊富な供給源となっています。医療現場で一般的に使用されるスタチン、ペニシリン、パクリタキセル、ラパマイシン、またはアルテミシニンなどの医薬品は、最初に同定され、天然物から単離されています。しかし、天然源からの生物学的に活性な特殊代謝産物の同定および単離は、困難で時間のかかるプロセスである。伝統的に、個々の代謝産物は、バイオマスの抽出に続いて、複雑な混合物から単離および精製される。続いて、単離された分子を機能アッセイにおいて試験し、それらの生物学的活性を検証する。ここでは、複雑な混合物から直接生物学的に活性な化合物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの使用を紹介します。CMACカラムは、天然のリン脂質二重層環境に埋め込まれた固定化機能性膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化合物の同定を可能にします。これは標的を絞ったアプローチであり、新たに同定された小分子薬物候補で活性を調節しようとするTMPを知る必要がある。このプロトコルでは、多数の神経系疾患に対する創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を有するCMACカラムを調製するアプローチを提示する。この記事では、TrkB受容体を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株を使用して、固定化されたTrkB受容体を有するCMACカラムを組み立てるための詳細なプロトコルを提供する。我々はさらに、カラムの機能性を調査するためのアプローチと、TrkB受容体と相互作用する特殊な植物代謝産物の同定におけるその使用を提示する。
Introduction
植物混合物は、薬理学的に活性な化合物1に富んでおり、新薬ヒットおよびリード2、3、4、5の同定のための良好な供給源として役立つ。天然物からの新薬の発見は実り多いアプローチであり、現在承認されている多くの薬は、自然界で最初に同定された化合物に由来しています。天然化合物の化学的多様性は、化学的に合成された分子の人工ライブラリに匹敵することは困難です。多くの天然化合物は、ヒトタンパク質標的と相互作用し、調節し、進化的に最適化された薬物様分子と考えることができる6。これらの天然化合物は、神経学的障害6において使用する薬物鉛同定に特に適している。アルツハイマー病(AD)の管理のために現在FDAが承認している2つの薬は、天然アルカロイド、すなわちガランタミンとリバスチグミン(フィゾスチグミンの誘導体)に由来しています6。L-DOPA, 現在、パーキンソン病のための最も一般的に処方薬, 最初にソラマメから同定されました (Vicia faba L.)ペルゴリドおよびリスリド、ドーパミン作動性受容体アゴニストは、寄生菌クラビセプス・プルプレア由来の天然麦角アルカロイドの誘導体である8.レセルピンは、インドのヘビの根(Rauvolfia serpentina(L.ベンス、元クルツ)から単離されたアルカロイドであり、最初の抗精神病薬9の1つであった。近年、調節不全の免疫応答および全身性炎症は、大うつ病性障害または神経変性疾患などの多数の神経学的疾患の発症に関連している10。植物ベースの食事療法と他のライフスタイル介入は、高齢者の認知能力および機能的能力を改善することが見出されている11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21.トリテルペンおよびポリフェノールに属するある種の求電子性分子は、インビトロおよびインビボモデルの両方において炎症応答を調節することが見出されている12。例えば、α,β−不飽和カルボニル(例えば、クルクミン、シンナムアルデヒド)、またはイソチオシアネート基(例えば、スルフォラファン)を含む天然化合物は、マウスインターロイキン−3依存性プロB細胞株における炎症誘発性サイトカインの下流合成を阻害するToll様受容体−4(TLR4)二量体化を妨害する12、22.疫学的証拠は、複雑な食品マトリックス中に存在する食事性植物化学物質も、新薬リードの実行可能な供給源を構成する可能性があることを強く指摘している6。
植物ベースの食品を含む植物抽出物中に存在する生物学的に活性な分子の同定における主要な障害の1つは、調査されたサンプルの複雑さである。伝統的に、個々の化合物は単離され、精製され、続いて生物学的活性について試験される。このアプローチは、通常、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物の同定につながる。定義された分子標的を伴わない表現型創薬アプローチは、複雑な混合物のバイオガイド分画に依存する23。このアプローチでは、抽出物は、より複雑でないサブフラクションに分画され、その後、表現型アッセイで試験される。活性化合物の単離および精製は、アッセイにおいて検証された生物学的活性によって導かれる。特定の薬物標的の同一性の知識は、複雑な混合物中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定を有意にスピードアップし得る。これらのアプローチは、通常、分子標的、例えば酵素の固定化に基づいており、固体表面上の、磁気ビーズ23などが挙げられる。固定化された標的は、その後、スクリーニング実験において使用され、標的と相互作用する化合物の単離をもたらす。このアプローチは、細胞質ゾルタンパク質を標的とする化合物の同定に広く使用されてきたが、膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化学物質の同定にはあまり一般的に適用されていない23。TMPsの固定化におけるさらなる課題は、タンパク質の活性が、細胞膜リン脂質およびコレステロール23,24などの二重層中の他の分子との相互作用に依存するという事実に由来する。膜貫通標的を固定化しようとする場合、タンパク質と天然のリン脂質二重層環境との間のこれらの微妙な相互作用を保存することが重要です。
細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)では、精製されていないタンパク質と細胞膜断片が、人工膜(IAM)固定相粒子23に固定化される。IAM固定相は、ホスファチジルコリン類似体をシリカ上に共有結合することによって調製される。最近、遊離アミン基およびシラノール基が末端キャップされているIAM固定相の新規クラスが開発されている(IAM.パソコン。DD2粒子)。CMACカラム調製中、細胞膜断片は吸着によってIAM粒子の表面に固定化されます。
CMACカラムは、イオンチャネル(例えば、ニコチン性受容体)、GPCR(例えば、オピオイド受容体)、タンパク質トランスポーター(例えば、p-糖タンパク質)などを含む、異なるクラスのTMPを固定化するために今日まで使用されてきた24。固定化タンパク質標的は、標的と相互作用する小分子リガンドの薬力学(例えば、解離定数、Kd)の特性評価または結合動態(kon およびkoff)の決定、ならびに複合体マトリックス中に存在する潜在的な新薬リードの同定の過程において使用されてきた24.ここでは、多数の神経系疾患の創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を用いたCMACカラムの調製法を紹介します。
これまでの研究では、脳由来神経栄養因子(BDNF)/TrkB経路の活性化が、ADや大うつ病性障害などの特定の神経学的疾患の改善と関連していることが示されました25,26,27,28。ADのBDNFレベルおよびその受容体TrkB発現の減少、および同様の低下がAD29の動物モデルにおいて海馬機能を損なうことが報告された。BDNFのレベルの低下は、AD患者30、31、32の血清および脳において報告された。タウ過剰発現または過剰リン酸化は、初代ニューロンおよびAD動物モデルにおけるBDNF発現をダウンレギュレートすることが見出された33、34、35。さらに、BDNFは、インビトロおよびインビボでβアミロイド誘導神経毒性に対して保護効果を有することが報告された36。ラット脳へのBDNFの直接投与は、認知障害のある動物における学習および記憶を増加させることが示された37。BDNF/TrkBは、AD28,38を含む神経学的および精神医学的障害を改善するための有効な標的として浮上した。ADにおける治療法の開発のためにBDNF/TrkBシグナル伝達経路を標的にすることは、この疾患の理解を潜在的に強化するであろう39。残念なことに、BDNF自体は、その貧弱な薬物動態学的特性および有害な副作用のために治療として使用することができない40。TrkB/BDNF経路の小分子活性化剤が、潜在的なTrkBリガンドとして探索されている41、42、43。試験された低分子アゴニストのうち、7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF)はBDNF/TrkB経路41,44,45,46を活性化することが示されている。7,8-DHFの誘導体(R13;4-オキソ-2-フェニル-4H-クロメン-7,8-ジイルビス(メチルカルバメート))は、AD47の可能性のある薬物として現在検討されている。最近、いくつかの抗うつ薬がTrkBに直接結合し、BDNFシグナル伝達を促進することによって作用することが示され、様々な神経学的障害を治療するための有効な標的としてTrkBを追求することの重要性をさらに強調する48。
このプロトコルは、機能的なTrkBカラムおよびTrkB-NULLネガティブコントロールカラムをアセンブルするプロセスを記述している。カラムは、既知の天然物小分子リガンドである7,8-DHFを使用して特徴付けられます。さらに、TrkBと相互作用する化合物の同定のために、植物抽出物を例に挙げて複雑なマトリックスをスクリーニングするプロセスについて説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
特殊な代謝産物の複雑な混合物中に存在する活性化合物の同定は、非常に困難な作業である23。伝統的に、個々の化合物は単離され、その活性は異なるアッセイで試験される。このアプローチは、時間と費用がかかり、しばしば、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物23の単離および同定をもたらす。現在使用されているハイスループットスクリーニング…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C.A.は、トルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)2219-国際ポスドク研究フェローシッププログラムの支援を受けました。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立補完統合医療センターによって、賞番号1R41AT011716-01の下で支援されました。この研究は、米国生薬学会のスターターグラント、L.C.へのレジステクノロジーズ助成金によって部分的に支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon Plan Fluor | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
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