Hier stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Überwachung der Darmsäuerung bei Drosophila melanogaster mit optimalem Output vor. Wir verwenden dieses Protokoll zuerst für das Monitoring der Darmversauerung bei Drosophila melanogaster und demonstrieren dann seine Verwendung bei Nicht-Modell-Drosophila-Spezies.
Der Fruchtfliegenmitteldarm besteht aus mehreren Regionen, von denen jede aus Zellen besteht, die einzigartige physiologische Funktionen ausführen, die für das reibungslose Funktionieren des Darms erforderlich sind. Eine solche Region, die Kupferzellregion (CCR), ist im mittleren Mitteldarm lokalisiert und besteht zum Teil aus einer Gruppe von Zellen, die als Kupferzellen bekannt sind. Kupferzellen sind an der Magensäuresekretion beteiligt, einem evolutionär konservierten Prozess, dessen genaue Rolle kaum verstanden wird. Dieses Papier beschreibt Verbesserungen im aktuellen Protokoll, das zur Untersuchung der Übersäuerung des adulten Drosophila melanogaster-Darms verwendet wird, und zeigt, dass es bei anderen Fliegenarten angewendet werden kann. Insbesondere zeigt diese Arbeit, dass die Übersäuerung des Darms vom Ernährungszustand der Fliege abhängt und stellt ein Protokoll vor, das auf diesem neuen Befund basiert. Insgesamt zeigt dieses Protokoll die potenzielle Nützlichkeit der Untersuchung von Drosophila-Kupferzellen , um allgemeine Prinzipien aufzudecken, die den Mechanismen der Darmversauerung zugrunde liegen.
Im Insektendarm teilen Kupferzellen zelluläre und funktionelle Ähnlichkeiten mit den säureproduzierenden Magenparietalzellen (auch bekannt als oxyntisch) des Säugetiermagens. Diese Gruppe von Zellen setzt Säure in das Darmlumen frei. Die Funktion der Säuresekretion und Anatomie ist evolutionär erhalten. Die Hauptbestandteile der entladenen Säure sind Salzsäure und Kaliumchlorid. Der chemische Mechanismus der Säurebildung in den Zellen hängt von der Carboanhydrase ab. Dieses Enzym erzeugt aus CO2 und Wasser ein Bicarbonation, das ein Hydroxylion freisetzt, das dann durch eine Protonenpumpe im Austausch für Kalium in das Lumen abgegeben wird. Chlorid- und Kaliumionen werden über Leitfähigkeitskanäle in das Lumen transportiert, was zur Bildung von Salzsäure und Kaliumchlorid, dem Hauptbestandteil des Magensaftes, führt1,2,3,4.
Obwohl die Mechanismen der Säurebildung gut verstanden sind, ist viel weniger über die physiologischen Mechanismen bekannt, die die Säuresekretion regulieren. Ziel der Entwicklung dieser Methode ist es, die zellulären Wege, die die Säurebildung und -sekretion koordinieren, besser abzugrenzen und die Rolle der Säure bei der Vermittlung der Darmphysiologie und Homöostase zu bestimmen. Die Begründung für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik besteht darin, eine konsistente und zuverlässige Methode zur Untersuchung des Prozesses der Darmversauerung in Drosophila und Nicht-Modellorganismen bereitzustellen. Obwohl derzeit ein Standardprotokoll zur Bestimmung der Drosophila-Mitteldarmversauerung existiert2,5,6 wurde eine signifikante Variabilität im Ausmaß der Versauerung bei Wildtypfliegen (WT) beobachtet, während dieses Protokoll zur Untersuchung der Kupferzellfunktion verwendet wurde. Um die Grundlage für diese beobachtete Variabilität zu verstehen und konsistente Ergebnisse zu erhalten, wurden mehrere Aspekte des Standardprotokolls wie unten beschrieben optimiert.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Dissektion des Darms, um die CCR für den Versauerungsphänotyp zu visualisieren. Die aus den Kupferzellen freigesetzte Säure ist auf das CCR beschränkt, wenn der Darm intakt ist. Während der Dissektion kann jedoch eine durch darmruptur verursachte Leckage zur Diffusion von Säure aus dem CCR führen und zu einem Darm führen, der fälschlicherweise als negativ für die Übersäuerung bewertet wird. Darüber hinaus verblasst die gelbe Farbe, die auf eine Ans?…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erkennen an, dass die Unterstützung für die Arbeit im Labor des Autors durch einen HHMI Faculty Scholar Award und Startkapital des Children’s Research Institute am UT Southwestern Medical Center bereitgestellt wird.
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |