Biyomoleküler modellemede önemli bir beceri, proteinlerdeki aktif bölgelerin görüntülenmesi ve açıklamalarının gösterilmesidir. Bu teknik makromoleküler görselleştirme için dört popüler ücretsiz program kullanılarak gösterilmiştir: iCn3D, Jmol, PyMOL ve UCSF ChimeraX.
Biyomoleküler görselleştirme becerileri, biyolojik bilimlerde yapı-işlev ilişkileri ve moleküler etkileşimler gibi temel kavramları anlamak için çok önemlidir. Çeşitli programlar bir öğrencinin 3B yapıları manipüle etmesine izin verir ve biyomoleküler modelleme aktif öğrenmeyi teşvik eder, hesaplama becerileri oluşturur ve iki boyutlu ders kitabı görüntüleri ile yaşamın üç boyutu arasındaki boşluğu kapatır. Bu alandaki kritik bir beceri, makromolekülün küçük bir molekülle veya ligand ile etkileşime girebilen kısımlarını bağlayıcı etkileşimleri gösterecek şekilde görüntüleyen bir protein aktif bölgesini modellemektir. Bu protokolde, serbestçe kullanılabilen dört makromoleküler modelleme programı kullanarak bu süreci açıklıyoruz: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL ve UCSF ChimeraX. Bu kılavuz, belirli bir programın temellerini öğrenmek isteyen öğrencilerin yanı sıra biyomoleküler modellemeyi müfredatlarına dahil eden eğitmenler için tasarlanmıştır. Protokol, kullanıcının belirli bir görselleştirme programını kullanarak etkin bir siteyi modellemesini veya kullanılabilir ücretsiz programlardan birkaçını örneklemesine olanak tanır. Bu protokol için seçilen model, glikolizin ilk adımını katalizleyen heksakinez enziminin bir izoform olan insan glukozkinazdır. Enzim, alt tabakalarından birine ve kullanıcının katalitik kompleksteki etkileşimleri analiz etmesine izin veren reaktif olmayan bir substrat analoga bağlıdır.
Moleküler dünyanın temsillerini anlamak biyomoleküler bilimler1konusunda uzman olmak için kritik öneme sahiptir, çünkü bu tür görüntülerin yorumlanması biyolojik işlevi anlamanın anahtarıdır2. Bir öğrencinin makromoleküllere girişi genellikle hücre zarlarının, organellerin, makromoleküllerin vb.
Buna göre, üst bölüm moleküler yaşam bilimleri derslerinde biyomoleküler görsel okuryazarlığın gelişimi dikkat çekmiş, görselleştirme becerilerinin öğretilmesinin ve değerlendirilmesinin önemi ve zorlukları hakkında raporlanan bir dizi makale ile1,3,4,5,6,7,8,9 . Bu makalelere verilen yanıt, moleküler görselleştirme programlarının ve modellerinin zor kavramları hedeflemek için kullanıldığı tek bir kurumda tipik olarak bir yarıyıl içinde sınıf müdahalelerinin sayısında bir artış olmuştur2,10,11,12,13,14,15 . Ek olarak, araştırmacılar öğrencilerin belirli bir konuya yaklaşmak için biyomoleküler görselleştirme programlarını ve / veya modellerini nasıl kullandıklarını karakterize etmeyeçalıştılar 16,17,18,19. Kendi grubumuz BioMolViz, görsel okuryazarlıktaki kapsamlı temaları öğrenme hedeflerine ve hedeflerine alt bölümlere katan bir Çerçeve tanımladı20,21ve biz, görsel okuryazarlık becerilerini ölçmek için değerlendirmelerin geri tasarımında Çerçeveyi kullanmak üzere öğretim üyelerini eğiten atölyelere öncülük ediyoruz22.
Tüm bu çalışmaların merkezinde kritik bir beceri vardır: biyomoleküler görselleştirme programlarını kullanarak makromoleküllerin yapılarını manipüle etme yeteneği. Bu araçlar çeşitli platformlar kullanılarak bağımsız olarak geliştirilmiştir; bu nedenle, operasyonlarında ve kullanımlarında oldukça benzersiz olabilirler. Bu, programa özgü yönergeler gerektirir ve bir kullanıcının rahat olduğu bir programın tanımlanması, sürekli uygulamayı kolaylaştırmak için önemlidir.
Yapıları 3B olarak manipüle etmenin (modeli döndürme, seçme ve değiştirme) temellerinin ötesinde, önemli bir amaç bir proteinin aktif bölgesini modellemektir. Bu süreç, bir öğrencinin BiyoMolViz Çerçevesi tarafından açıklanan üç kapsamlı temada anlayışlarını geliştirmesine izin verir: moleküler etkileşimler, ligandlar / değişiklikler ve yapı-işlev ilişkileri20,21.
Biyomoleküler görselleştirme için dört popüler program seçeneği şunlardır: Jmol / JSmol23, iCn3D24, PyMOL25ve UCSF Chimera26,27. Chimera’ya yeni gelenleri, programın şu anda desteklenen sürümü olan Chimera moleküler görselleştirme programının yeni nesli olan UCSF ChimeraX’i kullanmaya teşvik ediyoruz.
Bu protokolde, insan glukozinin aktif bölgesini bağlı bir substrat analog kompleksi (PDB ID: 3FGU) ile modellemek ve belirli bağlama etkileşimlerini göstermek için ölçümleri görüntülemek için bu dört programın her birinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz28. Model, enzimin katalitik bir kompleksini temsil eder. Aktif bölgeyi kataliz öncesi durumda yakalamak için, ATP’nin hidrolize edilemeyen bir analogı glukokinez aktif bölgesine bağlandı. Bu fosfoaminofosfonik asit-adenilat ester (ANP), bu pozisyonda normal fosfor-oksijen bağlantısı yerine fosfor-azot bağı içerir. Aktif bölge ayrıca glikoz (modelde bcg olarak gösterilir) ve magnezyum (mg olarak gösterilir) içerir. Ek olarak, kristalizasyon çözücüslerinde kullanılan potasyum klorürden kaynaklanan yapıda bir potasyum iyonu (K) vardır. Bu iyon biyolojik fonksiyon için kritik değildir ve aktif alanın dışında bulunur.
Şekil 1: ATP/ANP yapıları. Fosfoaminofosfonik asit-adenilit esterine (ANP) kıyasla adenozin trifosfat (ATP) yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protokol, substrat analog kompleksinin bağlı ligandlarının seçimini ve hidrofobik ve van der Waals etkileşimleri de dahil olmak üzere ilgili moleküler etkileşimleri yapabilen amino asitleri ve su moleküllerini yakalayan bağlı kompleksin 5 Å’sı içindeki aktif bölge kalıntılarının tanımlanmasını göstermektedir.
Ekran başlangıçta proteinin büyük kısmını bir çizgi film temsilinde göstermek için manipüle edilir, aktif bölge amino asit kalıntıları, proteinin ilgili atomlarını göstermek ve moleküler etkileşimleri vurgulamak için çubuk temsilinde bulunur. Her program için protokolün3. Protokolün sonunda, görünümü basitleştirmek ve aktif bölgeye odaklanmak için protein karikatürü gizlenir.
Şekil 2: Programlar arasında yapı karşılaştırması. Gösterimi Ayarla adımını izleyen her programda 3FGU yapısının karşılaştırılması (her iletişim kuralının 2 veya 3. adımı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
CPK renklendirme aktif site amino asitlerine ve bağlı ligandlarauygulanır 29,30. Bu boyama şeması, çizgi, çubuk, top ve çubukta gösterilen moleküler modellerde ve alan doldurma temsillerinde farklı kimyasal elementlerin atomlarını ayırt eder. Hidrojen beyaz, azot mavi, oksijen kırmızı, kükürt sarı ve fosfor CPK boyama şemasında turuncudur. Geleneksel olarak, siyah karbon için kullanılır, ancak modern kullanımda karbon renklendirme değişebilir.
Hidrojen atomları kristal yapılarda görünmez, ancak bu programların her biri konumlarını tahmin edebilir. Hidrojen atomlarını büyük bir makromoleküler yapıya eklemek görünümü gizleyebilir, bu nedenle bu protokolde görüntülenmezler. Buna göre hidrojen bağları, bu yapılarda iki heteroatom (örneğin oksijenden oksijene, oksijenden nitrojene) merkezinden ölçülerek gösterilecektir.
Programa Genel Bakış
İndirilebilir Grafik Kullanıcı Arabirimleri (GÜ’ler): PyMOL (Sürüm 2.4.1), ChimeraX (Sürüm 1.2.5) ve Jmol (Sürüm 1.8.0_301) GUI tabanlı moleküler modelleme araçlarıdır. Bu üç arabirim, yazılan kodu girmek için komut satırlarına sahiptir; aynı özelliklerin çoğu GUI’deki menüler ve düğmeler aracılığıyla kullanılabilir. Bu programların komut satırındaki yaygın bir özellik, kullanıcının klavyedeki yukarı ve aşağı ok tuşlarını kullanarak önceki komutları yükleyip yeniden yürütebileceğidir.
Web tabanlı CE’ler: iCn3D (I-see-in-3D), ayrı bir uygulama yüklemeye gerek kalmadan Web’deki üç boyutlu makromoleküler yapıların ve kimyasalların etkileşimli görüntülenmesi için WebGL tabanlı bir görüntüleyicidir. Tam web sürümü düzenlenebilir bir komut günlüğüne sahip olsa da, komut satırı kullanmaz. JSmol, bir web sitesinde veya bir web tarayıcısı penceresinde kullanılmak üzere Jmol’un JavaScript veya HTML5 sürümüdür ve Jmol’a çok benzer. JSmol, animasyonlar da dahil olmak üzere çevrimiçi öğreticiler oluşturmak için kullanılabilir.
Proteopedia31,32, FirstGlance in Jmol33ve Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling’deki JSmol web arayüzü (JUDE) bu tür Jmol tabanlı çevrimiçi tasarım ortamlarına örnektir34. Proteopedia wiki, kullanıcının makromolekül bir yapıyı modellemesine ve web sitesi içinde bu modelleri içeren sayfalar oluşturmasına izin veren bir öğretim aracıdır35. JSmol kullanılarak üretilen Proteopedia sahne yazma aracı, bir GUI’yi Jmol GUI’de bulunmayan ek özelliklerle entegre eder.
Jmol ve iCn3D Java programlama diline dayanır; JSmol Java veya HTML5 kullanır ve PyMOL ve ChimeraX Python programlama dilini temel alıp kullanır. Bu programların her biri, RCSB Protein Veri Bankası’ndan 4 basamaklı alfasayısal PDB kimliği36 , 37altında indirilebilen protein veri bankası dosyalarını yükler. En yaygın dosya türleri, .pdb uzantısını içeren Protein Data Bank (PDB) dosyaları ve .cif uzantısını içeren Kristalografik Bilgi Dosyası (CIF veya mmCIF) ‘dir. CIF, Protein Veri Bankası için varsayılan dosya türü olarak PDB’nin yerini almıştır, ancak her iki dosya biçimi de bu programlarda çalışır. PDB dosyalarının aksine CIF kullanırken sıranın/yapının görüntülenme biçiminde küçük farklılıklar olabilir; ancak, dosyalar benzer şekilde çalışır ve farklılıklar burada ayrıntılı olarak ele alınmaz. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi’nin (NCBI) bir ürünü olan Moleküler Modelleme Veritabanı (MMDB), kategorik bilgilerin ilişkili olduğu PDB yapılarının bir alt kümesidir (örneğin, biyolojik özellikler, korunmuş protein etki alanları)38. NCBI’nin bir ürünü olan iCn3D, MMDB verilerini içeren PDB dosyalarını yükleyebilir.
Bir modeli görüntülemek için, kullanıcı yapı için ayrılmış Protein Veri Bankası sayfasından istediğiniz dosyayı indirebilir (örneğin, https://www.rcsb.org/structure/3FGU) ve ardından yapıyı açmak için programın açılır Dosya menüsünü kullanabilir. Tüm programlar ayrıca bir yapı dosyasını doğrudan arabirim üzerinden yükleme yeteneğine sahiptir ve bu yöntem protokoller içinde ayrıntılı olarak açıktır.
ChimeraX, Jmol ve PyMOL CE’lerin her biri, konsolun köşeyi sürükleyerek yeniden boyutlandırılabilen bir veya daha fazla penceresini içerir. iCn3D ve JSmol tamamen bir web tarayıcısında bulunur. iCn3D kullanırken, kullanıcının ekran boyutuna ve çözünürlüğe bağlı olarak tüm menü öğelerini ortaya çıkarmak için açılır pencerelerde kaydırma yapması gerekebilir.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokoller, her programı kullanarak enzimin aktif bölgesini görüntülemek için basit bir yöntem sağlar. Her programda adımları yürütmenin birden çok yolu olduğu belirtilmelidir. Örneğin, ChimeraX’te aynı görev açılır menüler, üstteki araç çubuğu veya komut satırı kullanılarak yürütülebilir. Belirli bir programı ayrıntılı olarak öğrenmek isteyen kullanıcıların, bu programlar için mevcut olan çevrimiçi öğreticileri, kılavuzları ve Vikileri keşfetmeleri teşvik edilir39,40,41,42,43,44,45,46.
Bu programlar için varolan kılavuzlar ve öğreticiler, bu protokoldeki öğeleri ayrı görevler olarak sunar. Etkin bir siteyi görüntülemek için, kullanıcının çeşitli kılavuzlardan ve öğreticilerden gerekli işlemleri sentezlemesi gerekir. Bu makale, etiketli etkin bir siteyi moleküler etkileşimlerle modellemek için doğrusal bir protokol sunarak, kullanıcıya diğer modellere ve programlara uygulanabilecek aktif site modellemesi için bir mantık sağlayarak mevcut öğreticileri güçlendirir.
Şekil 3: ChimeraX GUI. Açılan menüler, araç çubuğu, yapı görüntüleyicisi ve komut satırı etiketli ChimeraX GUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: açılan menüler, araç çubuğu, yapı görüntüleyici, komut günlüğü, setleri seçme açılır menüsü ve dizi ve ek açıklamalar açılır menüleri etiketli iCn3DGUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Jmol GUI. Açılır menüler, araç çubuğu, yapı görüntüleyici, açılır menü ve konsol/komut satırı etiketli Jmol GUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: PyMOL GUI. Açılır menüler, yapı görüntüleyici, adlar/nesne paneli, fare kontrolleri menüsü ve etiketli komut satırı ile PyMOL GUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, biyomoleküler modelleme için dört popüler programa uygulanan bir enzim aktif bölgesinin modellenimi için on adımlı bir süreci özetlemektedir. Protokolün kritik adımları şunlardır: aktif sahadaki ligandları tanımlamak, aktif bir bölge tanımlamak için 5 şiçindeki kalıntıları seçmek ve enzimin aktif bölge ligandları ile etkileşimlerini göstermek. Biyolojik işlevle ilgili ligandları ayırt etmek çok önemlidir, çünkü bu, kullanıcının ligandların bağlanmasında rol oynayabilecek 5 şiçindeki amino asit kalıntılarını tanımlamasına izin verir. Son olarak, moleküler etkileşimleri görüntülemek için programı kullanmak, kullanıcının bağlamayı teşvik eden moleküler etkileşimleri anlamak için gerekli becerileri geliştirmesini sağlar.
Bilgisayar tabanlı moleküler modelleme protokollerinin bir sınırlaması, belirli komutlara ve sözdizimine bağımlılıktır. Biyokimyasal protokoller prosedürdeki küçük değişikliklere karşı hoşgörülü olsa da, prosedüre yakından uyulmadığı takdirde bilgisayar tabanlı araştırmalar çılgınca farklı nihai ürünler sağlayabilir. Bu, belirli bir çıktıyı elde etmek için programa özgü sözdiziminin gerekli olduğu ve noktalama veya büyük harfte görünen önemsiz bir değişikliğin bir komutun başarısız olmasına neden olabileceği komut satırı arabirimlerini kullanırken özellikle önemlidir. Her program için, bir kullanıcının komut satırı girişlerini bulabileceği ve sorun giderebileceği çeşitli Vikiler ve kılavuzlar vardır; kullanıcı komut sözdiziminin ayrıntılarına dikkat etmelidir. Çoğu moleküler görselleştirme programı geri alma komutları içerse de, arabirimlerin karmaşıklığı nedeniyle, undo komutu her zaman yürütülen son adımı sadık bir şekilde tersine çevirmez. Bu nedenle, özellikle yeni kullanıcılar için geçerli çalışma durumunun kaydedileni genellikle teşvik edilir.
Modelin kendisini oluşturmak için kullanılan verilerden daha fazla sınırlamalar ortaya çıkabilir. Protein Veri Bankası’nın doğasında bulunan standartlar belirli bir tutarlılık düzeyi sağlarken, moleküler görselleştirme programlarının kullanıcıları genellikle bir protein işlemede beklenmedik etkilerle karşılaşacaktır. İlk olarak, çoğu yapı, proteinin tek bir modelini sağlayan X-ışını kristalografisi kullanılarak belirlenir; ancak, NMR yapıları genellikle birer birer görselleştirilebilen birden çok modelden oluşur. İkinci olarak, kristalografi veya kriyojenik elektron mikroskopi deneylerinden belirlenen yapılar, konumu aydınlatılamayan ve proteinin belirli temsillerinde boşluklar olarak görünen atomlar içerebilir. Protein yapıları, çubuk işlemede görüntülendiğinde, aynı amino asit omurgasından çıkıntı yapan iki grup olarak görünen yan zincirlerin alternatif konformasyonlarına sahip olabilir. Omurganın kısa bölümleri bile bu tür alternatif konformasyonlara sahip olabilir ve bazen ligandlar aktif bölgeye birden fazla bağlama uyumunda bindirilir.
Kristal bir yapı için, biriken 3D koordinatlar, bir protein kristalinin tekrarlayan birimini çoğaltmak için yeterli bilgi sağlayan asimetrik ünitenin tüm bileşenlerini içerir. Bazen, bu yapı proteinin biyolojik olarak aktif formuna kıyasla ek protein zincirleri içerecektir (örneğin, fetal hemoglobin mutant, PDB Kimliği: 4MQK). Buna karşılık, bazı programlar biyolojik olarak aktif ünitenin tüm zincirlerini otomatik olarak yükleyemeyebilir. Örneğin, SARS-CoV2 ana proteaz (PDB ID: 6Y2E), ChimeraX, PyMOL ve Jmol’de bu protokolde açıklanan komutlar kullanılarak alındığında biyolojik olarak aktif dimerin yarısını (iki protein zincirinden oluşur) yükler. Komutun küçük bir şekilde değiştirilmesi biyolojik olarak etkin dimer’ı yükleyecek olsa da, bu değerlendirme acemi modelleme programı kullanıcısı için basit olmayabilir. Ortaya çıkabilecek farklı bir konu, aktif sitenin veya substratın kendisinin tanımlanmasıdır. Kristalografik deneyler, nihai yapıya modellenebilen çeşitli moleküller kullanılarak gerçekleştirilir. Örneğin, sülfat molekülleri etkin bölgedeki fosfat bağlama bölgelerini bağlayabilir veya mekanizmayla ilgili olmayan diğer bölgeleri bağlayabilir. Bu moleküller aktif sitenin kendisinin doğru tanımlanmasını gizleyebilir ve hatta öğrenciye mekanizmanın bir parçası olduklarını önerebilir.
Muhtemelen, kullanıcı bu prosedürü diğer etkin / bağlayıcı sitelere uygulamak isteyebilir. Bu protokolü yeni protein aktif alanlarının analizini içeren gelecekteki çalışmada uygulamak için, kullanıcının bağlı ligandlardan hangisinin çalışmakla ilgili olduğunu tanımlaması gerekir. Bazı ligandlar protein fonksiyonu ile ilişkili değildir ve bunun yerine deneyi yapmak için kullanılan çözücü veya kristalizasyon koşullarının bir sonucudur (örneğin, 3FGU modelinde bulunan potasyum iyonu). Anahtar ligandlar orijinal makaleye danışılarak tanımlanmalıdır. Pratikle ve uygun olduğunda, satır komutu sözdizimini anlayan bir kullanıcı, istenen modelleme programı protokolünü herhangi bir enzim etkin sitesine uygulayabilecek ve seçtikleri diğer makromolekülleri modelleyebilecektir.
Bağlı substratların ve ligandların tanımlanması ve analiz edilmesi, edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS)ve COVID-19 47 ,48,49, 50 ,51,52 dahil olmak üzere hastalık tedavilerinde doğrudan iyileşmelere yol açan moleküler mekanizmaların ve yapı tabanlı ilaç tasarım çabalarının aydınlatılmasının merkezinde yeralır. . Bireysel moleküler görselleştirme programları farklı arayüzler ve kullanıcı deneyimleri sunarken, çoğu karşılaştırılabilir özellikler sunar. Biyomoleküler görselleştirme okuryazarlığının gelişimi için, üst düzey biyokimya öğrencilerinin yapı görselleştirmesine ve bu tür görüntüler oluşturmak için araçlara aşina olmaları önemlidir4,20,53. Bu, öğrencilerin ders kitaplarında ve dergi makalelerinde iki boyutlu görüntülerin yorumlanmasının ötesine geçmelerini ve yapısal verilerden kendi hipotezlerini daha kolay geliştirmelerini sağlar54Gelecekteki halk sağlığı sorunlarını ele almak ve biyokimyasal süreçlerin anlaşılmasını geliştirmek için gelişmekte olan bilim insanlarını hazırlayacaktır.
Özetle, bu protokol dört önde gelen ücretsiz makromoleküler modelleme programı kullanarak etkin site modellemesini ayrıntılarıyla belirtir. Topluluğumuz BioMolViz, biyomoleküler modellemede yazılıma özgü olmayan bir yaklaşım benimsiyor. Özellikle bir eleştiriden veya program özelliklerinin karşılaştırılmasından kaçındık, ancak her programı örnekleyen bir kullanıcı, bir programda makromoleküler modellemenin belirli yönlerini diğerine tercih ettiğini görecektir. Okuyucuları, bu protokolde hedeflenen biyomoleküler görselleştirme tabanlı öğrenme amaç ve hedeflerini ayrıntılı olarak ortaya çıkaran BioMolViz Çerçevesi’ni kullanmaya ve http://biomolviz.org’daki BioMolViz topluluk web sitesi aracılığıyla biyomoleküler görselleştirmeyi öğretme ve öğrenme kaynaklarını keşfetmeye davet ediyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma için fon Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanmıştır:
Lisans STEM Eğitim Burslarının Geliştirilmesi (Ödül #1712268)
Lisans Biyoloji Eğitiminde Lisansta Araştırma Koordinasyon Ağları (Ödül # 1920270)
Jmol hakkında yararlı tartışmalar için Westfield Üniversitesi Doktorası Karsten Theis’e minnettarız.
ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/ | |||
Computer | Any | ||
iCn3D (web-based only: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html) | |||
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/ | |||
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/ | |||
Mouse (optional) | Any | ||
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational |