Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Summary

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Abstract

A lesão da córnea na superfície ocular, incluindo queimadura química e trauma, pode causar cicatrizes graves, simbléfaro, deficiência de células-tronco límbicas da córnea e resultar em um grande defeito epitelial corneano persistente. O defeito epitelial com opacidade corneana e neovascularização periférica resulta em comprometimento visual irreversível e dificulta o manejo futuro, especialmente a ceratoplastia. Uma vez que o modelo animal pode ser usado como uma plataforma eficaz de desenvolvimento de fármacos, modelos de lesão corneana em camundongos e queimadura alcalina em epitélio corneano de coelho são desenvolvidos aqui. O coelho branco da Nova Zelândia é usado no modelo de queimadura alcalina. Diferentes concentrações de hidróxido de sódio podem ser aplicadas na área circular central da córnea por 30 s sob anestesia intramuscular e tópica. Após abundante irrigação salina isotônica normal, o epitélio corneano solto residual foi removido com broca corneana profundamente até a camada de Bowman dentro desta área circular. A cicatrização foi documentada pela coloração com fluoresceína sob luz azul de cobalto. Camundongos C57BL/6 foram utilizados no modelo traumático de epitélio corneano murino. A córnea central murina foi marcada com punch cutâneo de 2 mm de diâmetro e, em seguida, desbridada por removedor de anel de ferrugem corneana com broca de 0,5mm em estereomicroscópio. Esses modelos podem ser usados prospectivamente para validar o efeito terapêutico de colírios ou agentes mistos, como células-tronco, que potencialmente facilitam a regeneração epitelial corneana. Observando-se opacidade corneana, neovascularização periférica e congestão conjuntival com estereomicroscópio e software de imagem, os efeitos terapêuticos nesses modelos animais podem ser monitorados.

Introduction

A córnea humana é constituída por cinco camadas principais e desempenha um papel fundamental na refração ocular para manter a acuidade visual e a integridade estrutural para proteger os tecidos intraoculares¹. A parte mais externa da córnea é o epitélio corneano, composto por cinco a seis camadas de células que se diferenciam sequencialmente das células basais e se movem para cima para se desprender da superfície^ocular1. Comparada à córnea em humanos e coelhos da raça Nova Zelândia, a córnea de camundongos tem uma estrutura corneana semelhante, mas periferia mais fina do que a parte central devido a uma espessura reduzida no epitélio e no estroma². Devido à sua posição única no sistema óptico ocular, muitos insultos externos, como lesão mecânica, inoculação bacteriana e agentes químicos, podem facilmente colocar em risco a integridade epitelial e levar a um defeito epitelial que ameace a visão, ceratite infecciosa, derretimento da córnea e até perfuração da córnea.

Embora vários agentes terapêuticos, como lubrificantes, antibióticos, anti-inflamatórios, produtos auto-sorológicos e membrana amniótica já tenham sido usados para melhorar a reepitelização e reduzir a cicatrização, outras potenciais modalidades de tratamento que podem permitir a cicatrização de feridas, reduzir a inflamação e suprimir a formação de cicatrizes ainda estão sendo desenvolvidas e testadas em diferentes plataformas. Vários modelos animais para cicatrização de feridas epiteliais corneanas têm sido propostos, incluindo remoção do epitélio corneano com removedor de anel de ferrugem corneana em camundongos diabéticos³, arranhões lineares sobre o epitélio corneano de camundongos por agulha estéril 25 G para inoculação bacteriana⁴, remoção assistida por trefina do epitélio corneano por removedor de anel de ferrugem corneana⁵, cautério epitelial sobre metade da córnea e limbo⁶ , abrasão da córnea de coelho facilitada pela trefina por lâmina de bisturi embotada⁷ e lesão da córnea bovina por congelamento instantâneo em nitrogênio líquido⁸.

Além da lesão mecânica do epitélio corneano, agentes químicos também são insultos comuns à superfície ocular, especialmente agentes ácidos e alcalinos. O hidróxido de sódio (NaOH, 0,1-1 N por 30-60 s) é um dos produtos químicos comumente utilizados em modelos murinos e coelhos de queimadura química de córnea 9,10,11,12,13. Etanol a 100% também foi aplicado na córnea no modelo de queimadura química de ratos, seguido de raspagem mecânica adicional com lâmina cirúrgica¹⁴. Uma vez que a manutenção de uma superfície ocular saudável depende de unidades funcionais, incluindo as pálpebras, as glândulas meibomianas, o sistema lacrimal, a conjuntiva e a córnea, os modelos animais in vivo têm alguns méritos sobre células epiteliais da córnea cultivadas ex vivo ou tecidos corneanos. Neste artigo, o modelo de ferida por abrasão corneana em camundongo e o modelo de coelho de queimadura alcalina corneana são demonstrados.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais em estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Chang Gung Memorial Hospital e aderiram à declaração ARVO para uso de animais em pesquisas oftalmológicas e da visão. 1. Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos Preparação dos ratosAdministrar anestesia geral a camundongos C57BL/6 por administração intraperitoneal de cloridrato de cetamina (80-100 mg…

Representative Results

Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos:Após desbridamento in vivo do epitélio corneano de camundongos com removedor manual de anel de ferrugem corneana, uma área corneana central levemente deprimida com coloração fluoresceína positiva pode ser encontrada na área central de 2 mm (Figura 3A-B). Após a colheita do globo ocular do camundongo, ele foi facilmente fixado …

Discussion

Modelos de lesão corneana em camundongos e coelhos fornecem uma plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorar a cicatrização de feridas, testar novas terapêuticas e estudar mecanismos subjacentes de cicatrização de feridas e vias de tratamento. Diferentes modelos animais podem ser usados para um experimento de curto ou longo prazo, dependendo do objetivo da pesquisa. Por exemplo, depois de criar um defeito epitelial na córnea de camundongos in vivo, um defeito epitelial confinado pod…

Materials

6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics