Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas
Summary
El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.
Abstract
La enfermedad arterial periférica (EAP) es una causa importante de morbilidad resultante de la exposición crónica a factores de riesgo ateroscleróticos. Los pacientes que sufren de su forma más grave, la isquemia crónica que amenaza las extremidades (CLTI), se enfrentan a deficiencias sustanciales en la vida diaria, incluido el dolor crónico, la distancia limitada para caminar sin dolor y las heridas no cicatrizantes. Se han desarrollado modelos preclínicos en varios animales para estudiar la EAP, pero la isquemia de las extremidades posteriores del ratón sigue siendo la más utilizada. Puede haber una variación significativa en la respuesta al insulto isquémico en estos modelos dependiendo de la cepa de ratón utilizada y el sitio, el número y los medios de interrupción arterial. Este protocolo describe un método único que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS) para inducir de manera confiable la gangrena del footpad en ratones Friend Virus B (FVB) que se asemeja a la pérdida de tejido de CLTI. Si bien todavía se recomiendan los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión, como las imágenes de perfusión Doppler con láser (LDPI), se utiliza la perfusión intracardíaca del colorante lipofílico 1,1′-dioctadecil-3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) para etiquetar la vasculatura. La subscopía de barrido láser confocal de montaje completo permite la reconstrucción tridimensional (3D) de alta resolución de las redes vasculares de la almohadilla del pie que complementa los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión en modelos de isquemia de las extremidades posteriores.
Introduction
La enfermedad arterial periférica (EAP), caracterizada por una reducción del flujo sanguíneo a las extremidades debido a la aterosclerosis, afecta a 6,5 millones de personas en los Estados Unidos y a 200 millones de personas en todo el mundo1. Los pacientes con EAP experimentan una función reducida de las extremidades y calidad de vida, y aquellos con CLTI, la forma más grave de EAP, tienen un mayor riesgo de amputación y muerte con una tasa de mortalidad a 5 años cercana al 50%2. En la práctica clínica, se considera que los pacientes con índices tobillo-brazo (ABI) <0,9 tienen EAP, y aquellos con ABI <0,4 asociados con dolor en reposo o pérdida de tejido tienen CLTI3. Los síntomas varían entre los pacientes con ABI similares dependiendo de la actividad diaria, la tolerancia muscular a la isquemia, las variaciones anatómicas y las diferencias en el desarrollo colateral4. La gangrena de los dedos y las extremidades es la manifestación más grave de todas las enfermedades oclusivas vasculares que dan lugar a CLTI. Es una forma de necrosis seca que momifica los tejidos blandos. Además de la EAP aterosclerótica, también se puede observar en pacientes con diabetes, vasculitis como la enfermedad de Buerger y el fenómeno de Raynaud, o calcifilaxis en el contexto de la enfermedad renal terminal5,6.
Se han desarrollado varios modelos preclínicos para estudiar la patogénesis de PAD/CLTI y probar la eficacia de posibles tratamientos, el más común de los cuales sigue siendo la isquemia de las extremidades posteriores del ratón. La inducción de la isquemia de las extremidades posteriores en ratones se logra típicamente por la obstrucción del flujo sanguíneo de las arterias ilíacas o femorales, ya sea por ligadura de sutura, electrocoagulación u otros medios de constricción del vaso deseado7. Estas técnicas reducen drásticamente la perfusión a la extremidad posterior y estimulan la neovascularización en los músculos del muslo y la pantorrilla. Sin embargo, existen diferencias esenciales dependientes de la cepa murina en la sensibilidad a la lesión isquémica en parte debido a diferencias anatómicas en la distribución colateral8,9. Por ejemplo, los ratones C57BL / 6 son relativamente resistentes a la isquemia de las extremidades posteriores, lo que demuestra una función reducida de las extremidades, pero generalmente no hay evidencia de gangrena en la almohadilla del pie. Por otro lado, los ratones BALB / c tienen una capacidad inherentemente pobre para recuperarse de la isquemia y, por lo general, desarrollan la autoamputación del pie o la parte inferior de la pierna después de la ligadura de la arteria femoral sola. Esta respuesta grave a la isquemia estrecha la ventana terapéutica y puede impedir la evaluación longitudinal de la reperfusión y la función de las extremidades. Curiosamente, las diferencias genéticas en un único locus de rasgo cuantitativo localizado en el cromosoma murino 7 se han implicado en estas susceptibilidades diferenciales de ratones C57BL/6 y BALB/c a necrosis tisular y reperfusión de extremidades10.
En comparación con las cepas C57BL/6 y BALB/c, los ratones FVB demuestran una respuesta intermedia pero inconsistente a la ligadura de la arteria femoral sola. Algunos animales desarrollan gangrena en forma de uñas isquémicas negras o dedos momificados, pero otros sin signos manifiestos de isquemia11. La administración concomitante de clorhidrato de éster metílico de Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS)12, previene los mecanismos vasodilatadores compensatorios y aumenta aún más el estrés oxidativo en el tejido de las extremidades posteriores. En combinación con la ligadura o coagulación de la arteria femoral, este enfoque produce consistentemente una pérdida de tejido de la almohadilla del pie en ratones FVB que se asemeja a los cambios atróficos de CLTI, pero rara vez progresa a autoamputación de extremidades11. El estrés oxidativo es una de las características distintivas de PAD/CLTI y se propaga por disfunción endotelial y disminución de la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO)13,14. El NO es una molécula pluripotente que suele ejercer efectos beneficiosos sobre el flujo sanguíneo arterial y capilar, la adhesión y agregación plaquetaria, y el reclutamiento y activación de leucocitos13. También se ha demostrado que los niveles reducidos de NOS activan la enzima convertidora de angiotensina, que induce estrés oxidativo y acelera la progresión de la aterosclerosis15.
Una vez que se establece un modelo de isquemia de las extremidades posteriores, también se necesita monitorear la reperfusión posterior de las extremidades y el efecto terapéutico de cualquier tratamiento potencial. En el modelo de gangrena murina propuesto, el grado de pérdida de tejido se puede cuantificar primero utilizando la puntuación de Faber para evaluar la apariencia macroscópica del pie (0: normal, 1-5: pérdida de uñas donde la puntuación representa el número de uñas afectadas, 6-10: atrofia de los dígitos donde la puntuación representa el número de dígitos afectados, 11-12: atrofia parcial y completa del pie, respectivamente)9. Las mediciones cuantitativas de la perfusión de las extremidades posteriores se realizan típicamente utilizando LDPI, que se basa en las interacciones Doppler entre la luz láser y los glóbulos rojos para indicar la perfusión a nivel de píxeles en una región de interés (ROI)16. Si bien esta técnica es cuantitativa, no invasiva e ideal para mediciones repetidas, no proporciona detalles anatómicos granulares de la vasculatura de las extremidades posteriores16. Otras modalidades de imagen, como la tomografía microcomputarizada (micro-TC), la angiografía por resonancia magnética (ARM) y la microangiografía de rayos X, resultan costosas, requieren instrumentación sofisticada o son técnicamente desafiantes16. En 2008, Li et al. describieron una técnica para etiquetar los vasos sanguíneos dentro de la retina con el tinte lipofílico de carbocianina DiI17. DiI se incorpora a las células endoteliales y, por difusión directa, tiñe estructuras de membrana vascular como brotes angiogénicos y procesos seudópodos17,18. Debido a su entrega directa en las células endoteliales y la naturaleza altamente fluorescente del tinte, este procedimiento proporciona un marcado intenso y duradero de los vasos sanguíneos. En 2012, Boden et al. adaptaron la técnica de perfusión DiI al modelo de isquemia de las extremidades posteriores murinas a través de imágenes de montaje completo de los músculos aductores del muslo cosechados después de la ligadura de la arteria femoral19.
El método actual proporciona una forma relativamente económica y técnicamente factible de evaluar la neovascularización en respuesta a la isquemia de las extremidades posteriores y la terapéutica basada en genes o células. En una adaptación adicional, este protocolo describe la aplicación de la perfusión DiI para obtener imágenes de la vasculatura de la almohadilla del pie en alta resolución y 3D en un modelo murino de gangrena de las extremidades posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien la isquemia de las extremidades posteriores del ratón es el modelo preclínico más utilizado para estudiar la neovascularización en PAD y CLTI, existe una variación significativa en la gravedad y la recuperación de la isquemia dependiendo de la cepa específica del ratón utilizada y el sitio, el número y el método de interrupción arterial. La combinación de la ligadura de la arteria femoral y la administración IP de L-NAME puede inducir de manera confiable la gangrena de las extremidades posteriores en…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones a Z-J L y OC V de los Institutos Nacionales de Salud [R01HL149452 y VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. También agradecemos a la Instalación de Microscopía e Imágenes del Proyecto Miami para Curar la Parálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad de Miami por proporcionar acceso a su software de análisis y procesamiento de imágenes.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
Referenzen
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