O presente protocolo descreve a canonização aórtica e a perfusão retrógrada do coração murino neonatal ex-vivo . Uma estratégia de duas pessoas, usando um microscópio de dissecação e uma agulha de bitola pequena, permite a cannulação confiável. A quantificação da tensão contítil longitudinal é alcançada usando um transdutor de força conectado ao ápice do ventrículo esquerdo.
O uso do coração perfumado ex-vivo tem sido uma pedra angular da investigação isquemia-reperfusão desde o seu desenvolvimento por Oskar Langendorff há mais de um século. Embora essa técnica tenha sido aplicada a camundongos nos últimos 25 anos, seu uso nesta espécie tem sido limitado a animais adultos. O desenvolvimento de um método bem-sucedido para cannular consistentemente a aorta murina neonatal permitiria o estudo sistemático do coração isolado perfusado retrógrado durante um período crítico de desenvolvimento cardíaco em uma espécie geneticamente modificável e de baixo custo. A modificação da preparação de Langendorff permite a canulação e o estabelecimento de reperfusão no coração murino neonatal, minimizando o tempo isquêmico. A otimização requer uma técnica de duas pessoas para permitir a cannulação bem sucedida da aorta do rato recém-nascido usando um microscópio de dissecação e uma agulha modificada comercialmente disponível. O uso desta abordagem estabelecerá de forma confiável a perfusão retrógrada dentro de 3 minutos. Como a fragilidade do coração do camundongo neonatal e o tamanho da cavidade ventricular impedem a medição direta da pressão intraventricular gerada usando um balão, é necessário o uso de um transdutor de força conectado por uma sutura ao ápice do ventrículo esquerdo para quantificar a tensão contratitil longitudinal. Este método permite aos pesquisadores estabelecer com sucesso uma preparação isolada de coração murino de fluxo constante, permitindo o estudo da biologia cardíaca do desenvolvimento de forma ex-vivo . É importante ressaltar que este modelo será uma poderosa ferramenta para investigar as respostas fisiológicas e farmacológicas à isquemia-reperfusão no coração neonatal.
Os preparativos do coração ex-vivo têm sido um grampo de estudos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos há mais de um século. Decorrente do trabalho de Elias Cyon na década de 1860, Oskar Langendorff adaptou o modelo isolado de sapo para perfusão retrógrada, pressurizando a raiz aórtica para fornecer fluxo coronário com um perfusado oxigenado1. Usando sua adaptação, Langendorff foi capaz de demonstrar uma correlação entre circulação coronária e função mecânica2. O ex-vivo coração retrógrado perfumado, mais tarde homônimo apelidado de técnica Langendorff, tem permanecido uma pedra angular da investigação fisiológica, aproveitando sua simplicidade para estudar poderosamente o coração isolado na ausência de potenciais confundidores. A preparação de Langendorff foi modificada ainda mais para permitir que o coração ejete (o chamado “coração de trabalho”) e permita que o perfusato recircular3. No entanto, os principais pontos de interesse fisiológicos permaneceram inalterados. Tais pontos finais incluem medidas de função contratil, condução elétrica, metabolismo cardíaco e resistência coronariana4.
Para avaliar a função cardíaca em sua preparação cardíaca original, Langendorff mediu a tensão gerada pela contração ventricular no eixo longitudinal usando uma sutura conectada entre o ápice do coração e um transdutor de força. 5 A contração isométrica foi quantificada desta forma com tensão basal aplicada ao coração na ausência de preenchimento ventricular. O refinamento da abordagem levou a balões cheios de fluidos colocados no ventrículo esquerdo através do átrio esquerdo para avaliar o desempenho do miocárdio durante a contração isovolumica6. Para avaliar o ritmo cardíaco e a frequência cardíaca, os condutores de superfície podem ser colocados nos polos do coração para permitir que os investigadores gravem o eletrocardiograma. No entanto, pode-se esperar bradicardia relativa, dada a denervação obrigatória. O ritmo extrínseco pode servir para superar isso e eliminar a variabilidade da frequência cardíaca entre os experimentos1. Outra medida de desfecho, o metabolismo do miocárdio, pode ser avaliada medindo o teor de oxigênio e substrato metabólico no perfusato coronário e efluente e calculando a diferença entre eles7. A quantificação de lactato no efluente coronário pode auxiliar na caracterização de períodos de metabolismo anaeróbico como é visto com hipóxia, hipoperfusão, isquemia-reperfusão ou perturbações metabólicas7.
O trabalho original de Langendorff possibilitou o estudo do coração mamífero ex-vivo, usando gatos como tema principal5. A avaliação do coração de rato isolado ganhou popularidade em meados da década de 1900 com Howard Morgan, que detalhou o modelo de rato “coração de trabalho” em 19675. O uso de camundongos começou há apenas 25 anos devido à complexidade técnica, fragilidade tecidual e tamanho relativamente pequeno do coração murino. Apesar dos desafios associados ao estudo dos camundongos, os custos mais baixos e a facilidade da manipulação genética aumentaram o apelo e a demanda de tais preparações ex-vivo murinas. Infelizmente, a aplicação da técnica tem sido limitada a animais adultos, com camundongos juvenis de 4 semanas de idade sendo os mais jovens utilizados para o estudo ex-vivo até recentemente 8,9. Embora os camundongos juvenis sejam “relativamente imaturos” em comparação com os adultos, sua utilidade como sujeitos para estudos de biologia do desenvolvimento é limitada porque eles têm, em geral, desmamado de sua represa de nascimento e em breve começará a puberdade10. A adolescência ocorre muito além da transição pós-natal na utilização do substrato miocárdio de glicose e lactato para ácidos graxos11. Assim, a maioria das informações sobre as mudanças metabólicas no coração neonatal tem historicamente resultado de trabalhos ex-vivos em espécies maiores, como coelhos ecobaias 11.
De fato, existem abordagens alternativas para a preparação de Langendorff. Estes incluem experimentação in vitro, que carece de dados e contexto funcionais de órgãos inteiros, ou estudos in vivo. Isso pode ser tecnicamente desafiador e complicado confundindo variáveis como os efeitos cardiovasculares e respiratórios de um agente anestésico necessário, a influência da entrada neurohumoral, as consequências da temperatura do núcleo, o estado nutricional do animal e a disponibilidade desubstratos 12,13. Como a abordagem de Langendorff permite o estudo do coração isolado perfumado de forma ex-vivo de forma mais controlada na ausência de tais confundimentos, tem sido e continua a ser considerado uma poderosa ferramenta investigativa. Portanto, a técnica aqui apresentada dá aos pesquisadores uma abordagem experimental para o estudo ex-vivo do coração murino recém-nascido e limita o tempo para a reperfusão.
Investigar o coração durante períodos de desenvolvimento é uma consideração importante, dadas as amplas transições bioquímicas, fisiológicas e anatômicas que ocorrem durante o amadurecimento do miocárdio. Mudanças do metabolismo anaeróbico para a fosforilação oxidativa, alterações na utilização do substrato e progressão da proliferação celular para a hipertrofia são processos dinâmicos que ocorrem exclusivamente no coração imaturo11,14. Outro aspecto crítico do coração em desenvolvimento é que os estressores encontrados durante os períodos necessários podem produzir respostas elevadas no coração recém-nascido e alterar a suscetibilidade futura a insultos na idade adulta15. Embora o trabalho anterior tenha utilizado ratos, cordeiros e coelhos recém-nascidos para estudar o coração neonatal perfusado de Langendorff, os avanços que permitem o uso de camundongos são necessários dada a importância desta espécie para a pesquisa de biologia do desenvolvimento16. Para atender a essa necessidade, o primeiro modelo de coração recém-nascido perfusado por Murine Langendorff usando animais de 10 dias de idade foi recentemente estabelecido6. Apresentado aqui é um método para permitir a canulação aórtica bem sucedida e estabelecer perfusão retrógrada do coração murino recém-nascido isolado. Essa abordagem pode ser utilizada para farmacologia, isquemia-reperfusão ou estudos de metabolismo com foco em toda a função do órgão ou pode ser adaptada para o isolamento de cardiomiócitos.
O presente trabalho descreve a canonização aórtica bem sucedida e a perfusão retrógrada no coração isolado do camundongo recém-nascido. É importante ressaltar que permite aos pesquisadores superar as barreiras que a idade de murina jovem e o pequeno tamanho do coração apresentaram anteriormente8. Embora não seja complexa no design, a abordagem requer um grau significativo de habilidade técnica. Os principais passos que inevitavelmente desafiarão até mesmo os investigadores mais tecn…
The authors have nothing to disclose.
NIH/NINDS R01NS12706 (R.L.)
Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
24 G catheter | BD | 381511 | |
26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
26 G steel needle | BD | 305111 | |
5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
find spring scissors | Kent | INS600127 | |
Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
Heparin | Sagent | 400-01 | |
High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |