Évaluation locomotrice du modèle de la maladie de Parkinson à base de poisson zèbre adulte induit par la 6-hydroxydopamine

Summary

Le présent protocole décrit l’injection intracérébroventriculaire (ICV) de poissons zèbres adultes avec de la 6-hydroxydopamine neurotoxique (6-OHDA) au niveau du diencéphale ventral (Dn) et l’évaluation de la déficience et de la récupération ultérieure du comportement de nage après la llésion à l’aide du test en cuve ouverte, qui est accompagné d’une analyse à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo.

Abstract

Les limites des traitements actuels pour retarder la perte neuronale dopaminergique dans la maladie de Parkinson (MP) augmentent le besoin de thérapies alternatives qui peuvent restaurer ces neurones. Beaucoup d’efforts sont actuellement dirigés vers une meilleure compréhension de la neurorégénération à l’aide de modèles précliniques in vivo . Cette capacité de régénération pour l’auto-réparation est cependant inefficace chez les mammifères. Les animaux non mammifères comme le poisson-zèbre sont ainsi apparus comme un excellent modèle neurorégénératif en raison de sa capacité à s’auto-renouveler continuellement et à avoir une homologie cérébrale proche de celle des humains. Dans le cadre de l’effort visant à élucider les événements cellulaires impliqués dans la neurorégénération in vivo, nous avons établi le modèle de à base de poisson zèbre adulte induit par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Ceci a été réalisé grâce à la micro-injection intracérébroventriculaire (ICV) optimisée de 99,96 mM 6-OHDA pour ablation spécifique des neurones dopaminergiques (DpN) dans le diencéphale ventral (Dn) du cerveau du poisson-zèbre. L’immunofluorescence a indiqué plus de 85 % de l’ablation de la DpN au troisième jour après la llésion et la restauration complète de la DpN au site lésionné 30 jours après la lèse. La présente étude a déterminé l’altération et la récupération subséquente du comportement de nage du poisson-zèbre après une lésion en utilisant le test en plein champ à travers lequel deux paramètres, la distance parcourue (cm) et la vitesse moyenne (cm / s), ont été quantifiés. La locomotion a été évaluée en analysant les enregistrements des poissons individuels de chaque groupe (n = 6) à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo. Les résultats ont montré une réduction significative (p < 0,0001) de la vitesse (cm / s) et de la distance parcourue (cm) du poisson zèbre lésionné 3 jours après la lèse par rapport au simulacre. Le poisson-zèbre lésionné a montré une récupération complète du comportement de nage 30 jours après la lèse. Les résultats actuels suggèrent que le poisson-zèbre adulte sectionné au 6-OHDA est un excellent modèle de qualité reproductible pour faciliter l’étude de la neurorégénération dans la MP. Des études futures sur les mécanismes sous-jacents à la neurorégénération ainsi que sur les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui modulent le processus pourraient fournir des informations importantes sur les nouvelles stratégies de traitement de remplacement cellulaire contre la MP.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP), une maladie caractérisée distinctement par la rigidité musculaire, les tremblements au repos et la bradykinésie, est la maladie neurologique qui connaît la croissance la plus rapide au ^monde1,2. Le risque et la prévalence de la MP augmentent rapidement avec l’âge, en particulier chez les personnes âgées de 50 ans et ^plus3. L’étiologie et la pathogenèse de la MP restent jusqu’à présent mal comprises. Cela a souvent laissé l’apparition précoce de la MP non diagnostiquée. À l’heure actuelle, le manque de dopamine et la perte de neurones dopaminergiques (DpN) chez les patients atteints de MP sont fortement liés à la manifestation de symptômes ^moteurs4. Capitalisant sur cette relation, plusieurs traitements ont été conçus soit pour agir directement comme remplacement de la dopamine (c.-à-d. la lévodopa), soit pour compenser la perte de DpN (c.-à-d. stimulation cérébrale profonde). Bien que ces traitements apportent des avantages symptomatiques, ils ne modifient pas l’évolution de la ^maladie5. Compte tenu de cette faiblesse importante, une thérapie de remplacement cellulaire a été proposée. L’efficacité de cette approche est toutefois incohérente compte tenu des défis de la préparation du greffon, du contrôle de la croissance cellulaire et de l’instabilité du phénotype. La thérapie de remplacement cellulaire, qui avait soulevé des préoccupations éthiques, pose également le risque d’induire des tumeurs cérébrales et des réactions immunitaires ^{indésirables6,7}.

Les limites des stratégies thérapeutiques actuelles ont conduit à mettre davantage l’accent sur la régénération de la DpN en tant qu’approche potentielle dans le traitement de la MP. La régénération de la DpN ou neurorégénération est apparue comme l’une des percées prometteuses dans la prise en charge de la MP, non seulement en raison de son potentiel en tant que nouvelle méthode thérapeutique, mais aussi en tant que moyen de comprendre le mécanisme de la ^{maladie8, 9. L}‘ Cette approche se concentre sur la restauration de la fonction neuronale par la différenciation, la migration et l’intégration des cellules progénitrices existantes dans les circuits ^{lésionnés10}. Afin d’explorer davantage la neurorégénération, diverses études in vivo ont été entreprises. Il a été constaté que les vertébrés tels que les mammifères, les amphibiens et les reptiles génèrent de nouvelles cellules cérébrales après une ^{blessure11,12}. Chez les vertébrés, les mammifères sont plus recherchés étant donné leur ressemblance génétique avec les êtres humains. Les mammifères, cependant, présentent une capacité réparatrice limitée et médiocre dans le système nerveux central (SNC) qui peut durer jusqu’à l’âge adulte après une lésion ^{cérébrale13}. En général, les mammifères ne sont pas adaptés en tant que modèles animaux pour comprendre la neurorégénération étant donné que le faible nombre de neurones produits ne sera pas suffisant pour restaurer les circuits neuronaux endommagés observés dans la MP. En tant que tel, le modèle basé sur le téléostéen, en particulier chez le poisson-zèbre, est grandement favorisé pour son taux de prolifération élevé, sa capacité à s’auto-renouveler continuellement et son homologie cérébrale proche des ^humains14,15.

Le poisson-zèbre est le plus souvent utilisé pour étudier les troubles du mouvement dans ^PD16. Le modèle à base de poisson-zèbre est généralement induit par des neurotoxines, qui comprennent la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) et la 6-hydroxydopamine (6-OHDA)¹⁷. Bien qu’efficaces pour induire une perte spécifique de DpN et une diminution des niveaux de dopamine, les modèles basés sur mpTP n’imitent pas étroitement les conditions de la MP car la perte de DpN ne se limite pas uniquement au ^SNC18. L’incapacité du 6-OHDA à traverser la barrière hémato-encéphalique a limité ses effets sur les changements cellulaires et fonctionnels dans le cerveau lorsqu’il est administré par voie intracrânienne par opposition à ^{intramusculaire19}. L’administration périphérique de 6-OHDA a entraîné une réduction globale des niveaux de dopamine dans tout le système ^nerveux20. Alors que l’administration de 6-OHDA dans le liquide céphalo-rachidien a provoqué une ablation de DpN dans tout le ^CNS21, ce qui n’imite pas la condition comme on le voit dans où la perte de DpN se produit spécifiquement à la substantia nigra du cerveau humain. L’administration de 6-OHDA par ICV, au contraire, a spécifiquement induit une ablation significative de DpN dans la zone de Dn ventral dans le cerveau du poisson zèbre, qui ressemblait beaucoup à substantia ^nigra22. Fait intéressant, la récupération de la DpN a été rapportée 30 jours après la lésion induite par 6-OHDA et ces neurones ont survécu au cours de la ^vie23,24. La récupération fonctionnelle de la DpN a été démontrée par une évaluation locomotrice de la distance parcourue (cm) et de la vitesse moyenne (cm/s) à l’aide du modèle ^PD22 à base de poisson zèbre adulte induit par 6 OHDA.

Protocol

La présente étude a été approuvée par le Comité de la recherche et de l’éthique animales (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [N° de référence : UiTM CARE 346/2021, en date du 7 mai 2021]. REMARQUE: Les protocoles publiés22,25,26 pour l’élevage standard et l’entretien du modèle de poisson zèbre adulte à lésion 6-OHDA ont été utilisés. Des expériences ont été menées su…

Representative Results

La présente expérience a évalué les changements dans le comportement de nage du poisson zèbre adulte après la micro-injection de CICV avec 6-OHDA. La raison de l’utilisation de la 6-OHDA comme neurotoxine de choix était due à son incapacité à traverser la barrière hémato-encéphalique, ce qui a produit une ablation spécifique et ciblée de la DpN dans la zone du diencéphale ventral d’intérêt (Dn)16. La sous-population DpN présente ici une ressemblance anatomique avec la sous-p…

Discussion

Les présents travaux ont démontré avec succès l’évaluation locomotrice du modèle établi de à base de poisson zèbre adulte induit par 6-OHDA. L’ensemble de l’expérience comportait trois étapes principales : les préparations de micro-injection pré-ICV, la micro-injection ICV du poisson-zèbre et l’évaluation locomotrice. Afin d’assurer la récupération saine du poisson-zèbre adulte après la procédure de micro-injection ICV et de bons résultats expérimentaux, certaines bonnes pratiques pour cha…

Materials

Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
Ascorbic acid	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
Nice conical flask, 100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	106404
Stereomicroscope	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
Equipment
ANY-maze software	Stoelting Co., Illinois, USA	–	version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV microinjector	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED Portable Lamp	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda aquarium heater	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
Thermometer	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
Video camera	Nikon, Tokyo, Japan	D3100