从土壤中分离可培养酵母和霉菌以研究真菌种群结构
Summary
该方案是一种有效，快速的方法，可在短短7天内从大量土壤样品中培养酵母菌和 霉菌烟曲霉 。这些方法可以很容易地修改，以适应实验所需的一系列培养基和温度。
Abstract
土壤是大量微生物生命的宿主，每克含有多达数十亿个细菌，古菌和真菌细胞。多细胞真菌，如霉菌和单细胞真菌，广义上定义为酵母，在土壤生态系统中作为有机物质的分解者和作为其他土壤居民的食物来源发挥着至关重要的作用。土壤中的真菌物种多样性取决于多种气候因素，如降雨和温度，以及土壤特性，包括有机质，pH值和湿度。缺乏足够的环境采样，特别是在亚洲，非洲，南美洲和中美洲地区，阻碍了土壤真菌群落的表征和新物种的发现。
我们使用约4，000个土壤样本和实验室开发的酵母和霉菌分离方案，对六大洲九个国家的土壤真菌群落进行了表征。该方案首先在液体培养基中对酵母和医学上相关的霉菌 烟曲霉菌进行单独的选择性富集，同时抑制细菌生长。然后将产生的菌落转移到固体培养基中并进一步加工以获得纯培养物，然后进行下游遗传表征。酵母物种同一性 是通过 对核核糖体RNA基因簇的内部转录间隔物（ITS）区域进行测序来建立的，而 烟曲霉菌 的全球种群结构 则通过 微卫星标记分析进行探索。
该协议已成功应用于分离和表征喀麦隆，加拿大，中国，哥斯达黎加，冰岛，秘鲁，新西兰和沙特阿拉伯的土壤酵母菌和 烟曲霉菌 种群。这些发现揭示了对土壤酵母多样性全球模式以及 烟曲霉菌全球种群结构和抗真菌性特征的急需见解。本文介绍了从国际土壤样品中分离酵母菌和 烟曲霉 的方法。
Introduction
土壤生态系统中的真菌在有机质分解、养分循环和土壤施肥中起着至关重要的作用1.非培养物（即高通量测序）和培养依赖性方法都广泛用于土壤真菌的研究2，3。虽然高通量元条形码测序产生的大量数据有助于阐明群落结构和多样性的广泛模式，但依赖于培养的方法可以提供关于真菌群落分类和功能结构的高度互补信息，以及由于纯真菌培养物的可用性，通过下游多样性和功能分析提供更具体的个体生物体概况。
尽管每克土壤很少超过数千个细胞，但酵母（广义上定义为单细胞真菌）是其他土壤居民必不可少的分解者和食物来源4，5。事实上，酵母可能是寒冷生物圈（如南极洲大陆6，7）中的主要土壤真菌。土壤也是医学相关酵母菌的主要宿主，这些酵母菌在人类和其他哺乳动物中引起严重的机会性感染8。尽管形态相似，酵母菌种类在系统发育上是多样的，并且发生在真菌王国9内的两个主要门的丝状真菌中，子囊菌和担子菌科。酵母在真菌条形码基因（核糖体RNA基因簇10的内部转录间隔（ITS）区域）缺乏明确的DNA特征，这使得它们在宏基因组学研究中与其他真菌难以区分，因此需要使用依赖于培养的方法来分离酵母物种。
实施以下方案是为了表征九个国家的土壤酵母群落，并确定土壤酵母多样性的全球趋势和模式9，11，12。在研究酵母2，3等目标生物群时，宏基因组学方法的用途有限。由于其系统发育多样性，酵母不能仅根据DNA序列与其他真菌区分开来。因此，研究酵母群需要继续使用培养物依赖性分离。然而，培养通常要耗时得多，并且需要更多的人员来进行实验。因此，该协议已经过优化和简化，以便在有限的人员内更快地进行处理。培养的主要优点是确定的酵母种类是活酵母而不是死酵母，因此更有可能是真正的土壤居民，而不是土壤中存在的瞬时细胞。据估计，土壤中大约40%的真菌DNA是来自其他环境的污染物，细胞外的污染物，或者来自不再完整的细胞，导致高通量测序方法高估真菌丰富度高达55%13。培养依赖性分离可以很容易地确认酵母物种的特性，并具有确保纯培养物用于下游分析的额外好处。事实上，使用这种土壤分离方案鉴定了44种假定的新酵母物种的纯培养物，该方案允许使用一系列方法来详细研究其分类学和功能特性14.
下面的方案也可用于分离土壤中存在的霉菌，例如 烟曲霉。 烟曲霉 是一种嗜热和腐生霉菌，在土壤中广泛分布全球15.它已从众多临床和非临床环境中分离出来。非临床采样通常包括空气、有机碎片（堆肥、锯末、郁金香球茎废料）和土壤（农业、花园和天然土壤）16、17、18、19。 烟曲霉菌 是一种人类机会性病原体，可引起一系列感染，统称为曲霉病，影响全球超过800万人16，20。全球约有300，000人患有侵袭性曲霉病，这是曲霉病最严重的形式16。根据患者群体、感染部位和抗真菌治疗效果等因素，死亡率可高达 90%。在过去的几十年中，抗真菌疗法的耐药性有所增加，需要临床和环境人群的全球监测工作来追踪这些耐药性基因型21，22，23。鉴于其在高于50°C的温度下生长的能力，可以利用该温度使用依赖性方法从土壤中选择 烟曲霉 分离物。 烟曲霉菌 分离株通常在九个高度多态的短串联重复（STR）位点进行基因分型，显示菌株24之间具有很高的鉴别力。这些STR基因型可以与先前调查的其他人群进行比较，以追踪 烟曲霉菌 基因型（包括耐药性基因）在世界各地的传播。
下面我们描述了以培养依赖性的方式从土壤样品中快速分离酵母菌和 烟曲霉 的方案。根据每个样品获得的土壤量，土壤样品可以在两个方案之间共享。与从土壤中分离酵母和 烟曲霉菌 的类似方法相比，该方案每获得一个分离物使用的土壤减少了10倍。试图从土壤中分离 出烟曲霉菌 的研究需要每个分离物1至2克土壤，而该方案只需要0.1-0.2克土壤18，19，25。该协议利用较小的塑料和容器，促进其高通量设计。因此，可以使用更少的空间为培养箱和滚筒等设备处理大量样品。土壤样品可以完全处理，在短短7天内获得分离物。该协议已经过优化，允许每人每天处理多达150-200个样本。
Protocol
Representative Results
Discussion
为从土壤中分离酵母菌和 烟曲霉菌 而开发的方案是一种快速有效的高通量土壤处理和真菌分离方法。该协议只需要每个样品少量的土壤（0.1-0.2g），允许以类似的努力对更多地点进行采样。快速的周转时间确保可以在短时间内获得结果，并允许在必要时进行故障排除和重复实验。该协议可以使用标准微生物学和细胞培养设备在许多实验室环境中轻松复制。但是，当从国际土壤中分离酵母或…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了加拿大自然科学和工程研究理事会的资助（拨款编号：1000）的支持。ALLRP 570780-2021）和麦克马斯特大学。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
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