Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo
Summary
Questo protocollo presenta un riepilogo dettagliato delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. Esemplificato per i funghi Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, vengono descritti tre diversi sistemi di infezione delle radici. Vengono evidenziate le potenziali applicazioni e le possibili analisi a valle e vengono discussi vantaggi o svantaggi per ciascun sistema.
Abstract
La rizosfera ospita una comunità microbica altamente complessa in cui le radici delle piante sono costantemente sfidate. Le radici sono a stretto contatto con un’ampia varietà di microrganismi, ma gli studi sulle interazioni trasmesse dal suolo sono ancora indietro rispetto a quelli eseguiti su organi fuori terra. Sebbene alcune strategie di inoculazione per infettare piante modello con patogeni radicali modello siano descritte in letteratura, rimane difficile ottenere una panoramica metodologica completa. Per affrontare questo problema, vengono descritti con precisione tre diversi sistemi di inoculazione delle radici che possono essere applicati per ottenere informazioni sulla biologia delle interazioni radice-microbo. Per esempio, le specie di Verticillium (vale a dire, V. longisporum e V. dahliae) sono state impiegate come patogeni modello di invasione delle radici. Tuttavia, i metodi possono essere facilmente adattati ad altri microbi colonizzanti le radici, sia patogeni che benefici. Colonizzando lo xilema vegetale, i funghi vascolari trasmessi dal suolo come il Verticillium spp. esibiscono uno stile di vita unico. Dopo l’invasione delle radici, si diffondono attraverso i vasi xilemici acropetalmente, raggiungono il germoglio e suscitano sintomi di malattia. Tre specie vegetali rappresentative sono state scelte come ospiti modello: Arabidopsis thaliana, colza economicamente importante (Brassica napus) e pomodoro (Solanum lycopersicum). Vengono forniti protocolli passo-passo. Vengono mostrati risultati rappresentativi di saggi di patogenicità, analisi trascrizionali di geni marcatori e conferme indipendenti da parte di costrutti reporter. Inoltre, i vantaggi e gli svantaggi di ciascun sistema di inoculazione sono discussi in modo approfondito. Questi protocolli collaudati possono aiutare a fornire approcci per domande di ricerca sulle interazioni radice-microbo. Sapere come le piante affrontano i microbi nel terreno è fondamentale per sviluppare nuove strategie per migliorare l’agricoltura.
Introduction
I terreni naturali sono abitati da un numero sorprendente di microbi che possono essere neutri, dannosi o benefici per le piante1. Molti agenti patogeni delle piante sono trasmessi dal suolo, circondano le radici e attaccano l’organo sotterraneo. Questi microrganismi appartengono a un’ampia varietà di cladi: funghi, oomiceti, batteri, nematodi, insetti e alcuni virus 1,2. Una volta che le condizioni ambientali favoriscono l’infezione, le piante sensibili si ammaleranno e le rese delle colture diminuiranno. Gli effetti dei cambiamenti climatici, come il riscaldamento globale e gli estremi meteorologici, aumenteranno la percentuale di patogeni vegetali trasmessi dal suolo3. Pertanto, diventerà sempre più importante studiare questi microbi distruttivi e il loro impatto sulla produzione di alimenti e mangimi, ma anche sugli ecosistemi naturali. Inoltre, ci sono mutualisti microbici nel terreno che interagiscono strettamente con le radici e promuovono la crescita, lo sviluppo e l’immunità delle piante. Di fronte agli agenti patogeni, le piante possono reclutare attivamente avversari specifici nella rizosfera che possono supportare la sopravvivenza dell’ospite sopprimendo i patogeni 4,5,6,7. Tuttavia, i dettagli meccanicistici e i percorsi coinvolti nelle interazioni benefiche radice-microbo sono spesso ancora sconosciuti6.
È quindi essenziale espandere la comprensione generale delle interazioni radice-microbo. Sono necessari metodi affidabili per inoculare radici con microrganismi trasmessi dal suolo per eseguire studi modello e trasferire i risultati alle applicazioni agricole. Le interazioni benefiche nel suolo sono studiate, ad esempio, con Serendipita indica (precedentemente nota come Piriformospora indica), Rhizobium spp. che fissa l’azoto o funghi micorrizici, mentre noti patogeni vegetali trasmessi dal suolo includono Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. e Verticillium spp.1. Gli ultimi due sono generi fungini che sono distribuiti a livello globale e causano malattie vascolari2. Verticillium spp. (Ascomycota) può infettare centinaia di specie vegetali – in gran parte dicotiledoni, tra cui annuali erbacee, piante perenni legnose e molte piante coltivate 2,8. Le Ife di Verticillium entrano nella radice e crescono sia intercellulari che intracellulari verso il cilindro centrale per colonizzare i vasi xilema 2,9. In questi vasi, il fungo rimane per la maggior parte del suo ciclo vitale. Poiché la linfa dello xilema è povera di nutrienti e trasporta composti di difesa delle piante, il fungo deve adattarsi a questo ambiente unico. Ciò si ottiene con la secrezione di proteine correlate alla colonizzazione che consentono all’agente patogeno di sopravvivere nel suo ospite10,11. Dopo aver raggiunto la vascolarizzazione radicale, il fungo può diffondersi all’interno dei vasi xilema acropetalmente al fogliame, il che porta alla colonizzazione sistemica dell’ospite 9,12. A questo punto, la pianta è influenzata negativamente nella crescita 9,10,13. Ad esempio, si verificano arresto della crescita e foglie gialle e senescenza prematura 13,14,15,16.
Un membro di questo genere è verticillium longisporum, che è altamente adattato agli ospiti brassicacei, come la colza agronomicamente importante, il cavolfiore e la pianta modello Arabidopsis thaliana12. Diversi studi hanno combinato V. longisporum e A. thaliana per ottenere ampie informazioni sulle malattie vascolari trasmesse dal suolo e sulle conseguenti risposte di difesa delle radici 13,15,16,17. Semplici test di suscettibilità possono essere realizzati utilizzando il sistema modello V. longisporum / A. thaliana e risorse genetiche consolidate sono disponibili per entrambi gli organismi. Strettamente correlato a V. longisporum è l’agente patogeno Verticillium dahliae. Sebbene entrambe le specie fungine svolgano uno stile di vita vascolare e un processo di invasione simili, la loro efficienza di propagazione dalle radici alle foglie e i sintomi della malattia suscitati in A. thaliana sono diversi: mentre V. longisporum di solito induce la senescenza precoce, l’infezione da V. dahliae provoca l’appassimento18. Recentemente, un riassunto metodologico ha presentato diverse strategie di inoculazione radicale per infettare A. thaliana con V. longisporum o V. dahliae, assistendo nella pianificazione di configurazioni sperimentali19. Nel campo, V. longisporum causa occasionalmente danni significativi nella produzione di colza12, mentre V. dahliae ha una gamma di ospiti molto ampia che comprende diverse specie coltivate, come vite, patate e pomodoro8. Ciò rende entrambi i patogeni modelli economicamente interessanti da studiare.
Pertanto, i seguenti protocolli utilizzano sia V. longisporum che V. dahliae come patogeni radicali modello per esemplificare possibili approcci per le inoculazioni radicali. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica napus) e pomodoro (Solanum lycopersicum) sono stati scelti come ospiti modello. Descrizioni dettagliate delle metodologie sono disponibili nel testo sottostante e nel video di accompagnamento. Vengono discussi vantaggi e svantaggi per ciascun sistema di inoculazione. Nel complesso, questa raccolta di protocolli può aiutare a identificare un metodo adatto per domande di ricerca specifiche nel contesto delle interazioni radice-microbo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa delle enormi perdite di resa causate dai fitopatogeni trasmessi dal suolo1, è necessario un miglioramento delle strategie agricole o delle varietà di colture. La limitata comprensione della patogenesi delle malattie trasmesse dal suolo ostacola lo sviluppo di piante più resistenti. È necessario esplorare i meccanismi patologici sottostanti, per i quali è necessaria una solida piattaforma metodologica. Le procedure di inoculazione riportate hanno dimostrato che gli eventi multifattoria…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono Tim Iven e Jaqueline Komorek per il lavoro precedente su questi metodi, il gruppo di Wolfgang Dröge-Laser (Dipartimento di Biologia Farmaceutica, Università di Würzburg, Germania) per aver fornito le attrezzature e le risorse necessarie per questo lavoro, e Wolfgang Dröge-Laser e Philipp Kreisz (entrambi Università di Würzburg) per la correzione critica del manoscritto. Questo studio è stato sostenuto dalla “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
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