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Biologie

자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

Published: February 01, 2022
doi:
10.3791/63470
, , , , , , , ,
1Botanical Institute,Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5),Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie,Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.

Abstract

시아 노 박테리아는 태양 에너지가 바이오 매스 생산에 사용되는 기본 연구 및 생명 공학 프로젝트의 초점입니다. Phormidium lacuna는 새로 분리 된 필라멘트 성 시아 노박테리움입니다. 이 논문은 새로운 필라멘트 시아 노 박테리아가 해양 암석에서 어떻게 분리 될 수 있는지 설명합니다. 또한 필라멘트에서 DNA를 추출하는 방법과 게놈을 시퀀싱하는 방법을 설명합니다. 많은 단세포 종에 대해 형질전환이 확립되지만, 필라멘트성 시아노박테리아에 대해서는 덜 빈번하게 보고된다. P. lacuna의 자연 변형을위한 단순화 된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. P. lacuna는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 주문의 유일한 구성원입니다. 이 논문은 또한 자연 변형이 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)을 발현하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다. 내인성 cpcB 프로모터는 Synechocystis sp. PCC6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2 프로모터보다 약 5배 더 강한 발현을 유도하였다. 또한, P. lacuna 및 Synechocystis sp.CPP 6803의 동결보존을 위한 방법이 확립되었고, 액체 매질 및 한천 및 플라스틱 표면에서의 운동성을 평가하는 방법이 기재되어 있다.

Introduction

시아노박테리아는 광합성을 에너지원으로 활용하는 원핵생물이다1,2. 연구는 시아 노 박테리아 종에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 몇몇 시아노박테리아는 DNA3으로 형질전환될 수 있다. 유전자는 이들 종에서 녹아웃되거나 과발현될 수 있다. 그러나, 형질전환은몇몇 종 4,5,6,7,8,9,10,11 로 제한되며, 배양 수집 또는 야생 8로부터의 균주에서 형질전환을 확립하는 것은 어려울 수 있다. 필라멘트 종 Phormidium lacuna (그림 1)의 균주는 염 농도 또는 온도와 같은 환경 조건이 시간이 지남에 따라 변동하는 해양 암석 풀에서 분리되었습니다. 이 필라멘트 시아 노 박테리아는 그들이 속한 Oscillatoriales12 순서에 대한 모델 유기체로 사용될 수 있습니다.

전기천공에 의한 유전자 전달을 시험하는 시험 동안 13,14는 P. lacuna가 자연 형질전환(15)에 의해 형질전환될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 과정에서 DNA는 일부 세포에 의해 자연적으로 흡수됩니다. 변환16,17의 다른 방법과 비교할 때, 자연 변환은 절차를 복잡하게 만들 수있는 추가 도구가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 전기 천공에는 적절한 큐벳, 손상되지 않은 와이어 및 적절한 전압의 선택이 필요합니다. P. lacuna는 현재 자연 변형에 취약한 유일한 Oscillatoriales 회원입니다. 원래 프로토콜은 전기 천공 프로토콜을 기반으로하기 때문에 여전히 불필요 할 수있는 몇 가지 세척 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜을 단순화하기 위해 다양한 접근 방식을 테스트하여 여기에 제시된 변환 프로토콜로 이어졌습니다.

게놈 서열은 유전자 녹아웃 또는 과발현에 기초한 추가 분자 연구에 필수적이다. 게놈 서열은 단기간 내에 차세대 시퀀싱 기계로 얻을 수 있지만, DNA의 추출은 어려울 수 있으며 종에 따라 다릅니다. P. lacuna를 사용하면 몇 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 그런 다음 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 기반 방법이 확립되어 실험실에서 계속 작업하기 위해 각 정제주기의 DNA 순도 및 DNA 수율을 수용할 수 있게 되었습니다. 다섯 균주의 게놈은 이 프로토콜로 시퀀싱될 수 있었다. 다음 논리적 형질전환 단계는 P. lacuna에서 단백질 발현을 확립하는 것이었다.

이 프로토콜에서 마커 단백질로서 사용된 sfGFP는 임의의 형광 현미경으로 검출될 수 있다. 시험된 모든 프로모터는 P. lacuna sfGFP 발현을 위해 사용될 수 있었다. 형질전환으로부터 발생하는 균주의 수가 증가함에 따라 배양물을 저장하는 방법이 필요하게 되었다. 이러한 방법은 에스케리치아 콜라이 및 다른 많은 박테리아(18)에 대해 확립된다. 표준 프로토콜에서, 글리세롤 배양물을 제조하고, 액체 질소로 옮기고, -80°C에서 저장한다. 이 방법은 몇 단계 만 거치면 되며 확립 된 종에 대해 매우 신뢰할 수 있습니다. P. lacuna에 대한 표준 프로토콜은 살아있는 세포가 모든 경우에 회복 될 수 없었기 때문에 실현 가능하지 않았습니다. 그러나 해동 후 글리세롤을 제거했을 때 모든 시험의 세포는 생존했습니다. P. lacuna의 운동성 분석을 위해 간단한 방법이 제시되며, 이는 IV 형 필리 또는 광수용체의 역할을 조사하기 위해 녹아웃 돌연변이 유발과 결합 될 수 있습니다. 이들 검정은 단세포 시아노박테리아19,20,21의 분석과 다르며 또한 다른 오실라토리아에 유용할 수 있다.

Protocol

1. 자연 환경으로부터의 격리 참고 : 녹조류, 규조류, 사상 시아 노 박테리아 및 기타 미세 조류를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 조건에서 자라는 암석 풀의 모든 미세 조류 종에 사용할 수 있습니다. Oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노 박테리아는 움직임과 필라멘트 모양으로 쉽게 인식 할 수 있습니다. 상기 종은 게놈 시퀀싱 또는 16S rRNA 시퀀싱?…

Representative Results

상기 언급된 방법에 따라, P. lacuna 의 5개의 상이한 균주를 락풀로부터 분리하고 서열화하였다(도 1 및 표 1). 모든 배양물은 P. lacuna HE10JO를 제외한 계대 배양의 ∼1년 후에 멸균되었다. 이 균주는 여전히 해양 박테리아 인 Marivirga atlantica로 오염되어 있습니다. 후속 헬고랜드 여행 동안, 다른 필라멘트 시아 노 박테리아는 P. lacuna 와 다르?…

Discussion

시아노박테리아의 많은 균주가 배양 컬렉션32,33,34,35,36으로부터 이용가능하지만, 이들 종들이 특정 특성에 적응하기 때문에 야생으로부터 새로운 시아노박테리아에 대한 요구가 여전히 존재한다. P. lacuna는 암석 풀에서 수집되었으며 소금 농도 및 온도30…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 Karlsruher Institute of Technology의 지원을 받았습니다.

Materials

Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
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Referenzen

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Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).
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