Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse
Summary
Le présent protocole décrit la précipitation protéique à base de solvant dans des conditions contrôlées pour une récupération et une purification robustes et rapides des échantillons de protéome avant la spectrométrie de masse.
Abstract
Bien que les multiples progrès réalisés dans les instruments de spectrométrie de masse (SEP) aient amélioré l’analyse qualitative et quantitative du protéome, des approches frontales plus fiables pour isoler, enrichir et traiter les protéines avant la SEP sont essentielles à la caractérisation réussie du protéome. Une récupération faible et incohérente des protéines et des impuretés résiduelles telles que les tensioactifs nuisent à l’analyse de la SEP. La précipitation des protéines est souvent considérée comme peu fiable, longue et techniquement difficile à effectuer par rapport à d’autres stratégies de préparation d’échantillons. Ces préoccupations sont surmontées en utilisant des protocoles optimaux de précipitation des protéines. Pour la précipitation de l’acétone, la combinaison de sels spécifiques, le contrôle de la température, la composition du solvant et le temps de précipitation sont essentiels, tandis que l’efficacité de la précipitation du chloroforme / méthanol / eau dépend d’un pipetage et d’une manipulation du flacon appropriés. Alternativement, ces protocoles de précipitation sont rationalisés et semi-automatisés dans une cartouche de rotation jetable. Les résultats attendus de la précipitation des protéines à base de solvant dans le format conventionnel et de l’utilisation d’une cartouche de filtration et d’extraction jetable en deux étapes sont illustrés dans ce travail. Cela comprend la caractérisation détaillée des mélanges protéomiques par analyse ascendante LC-MS/MS. Les performances supérieures des flux de travail basés sur les FDS sont également démontrées par rapport aux protéines non contaminées.
Introduction
L’analyse du protéome par spectrométrie de masse est devenue de plus en plus rigoureuse, en raison de la sensibilité, de la résolution, de la vitesse de balayage et de la polyvalence accrues des instruments MS modernes. Les progrès de la SEP contribuent à une plus grande efficacité d’identification des protéines et à une quantification plus précise 1,2,3,4,5. Grâce à l’amélioration de l’instrumentation de la SEP, les chercheurs exigent une stratégie de préparation d’échantillons front-end cohérente capable de récupérer quantitativement des protéines de haute pureté en un minimum de temps à toutes les étapes du flux de travail 6,7,8,9,10,11 . Pour refléter avec précision l’état protéomique d’un système biologique, les protéines doivent être isolées de la matrice de l’échantillon natif de manière efficace et impartiale. À cette fin, l’inclusion d’un tensioactif dénaturant, tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS), assure une extraction et une solubilisation efficaces des protéines12. Cependant, les FDS interfèrent fortement avec l’ionisation par électropulvérisation, provoquant une suppression sévère du signal MS si elle n’est pas correctement éliminée13.
Diverses stratégies d’épuisement des FDS sont disponibles pour une analyse ultérieure du protéome, telles que la rétention de protéines au-dessus d’un filtre de coupure de poids moléculaire contenu dans des cartouches de spin jetables 14,15,16. La méthode de préparation d’échantillons assistée par filtre (FASP) est privilégiée car elle épuise efficacement les FDS en dessous de 10 ppm, facilitant ainsi une SEP optimale. Cependant, la récupération des protéines avec LE FASP est variable, ce qui a incité à l’exploration d’autres techniques. Les approches chromatographiques qui capturent sélectivement les protéines (ou tensioactifs) ont évolué en diverses cartouches pratiques ou formats à base de billes 17,18,19,20,21. Compte tenu de ces stratégies simples et (idéalement) cohérentes de purification des protéines, l’approche classique de la précipitation des protéines avec des solvants organiques est souvent négligée comme une approche prometteuse de l’isolement des protéines. Bien qu’il soit démontré que la précipitation des solvants épuise les FDS en dessous des niveaux critiques avec succès, la récupération des protéines est une préoccupation de longue date de cette approche. Plusieurs groupes ont observé un biais de récupération des protéines, avec des rendements de précipitations inacceptablement bas en fonction de la concentration en protéines, du poids moléculaire et de l’hydrophobicité22,23. En raison de la diversité des protocoles de précipitations rapportés dans la littérature, des conditions de précipitations normalisées ont été élaborées. En 2013, Crowell et al. ont signalé pour la première fois la dépendance de la force ionique à l’efficacité des précipitations des protéines dans 80% d’acétone24. Pour toutes les protéines examinées, l’ajout de chlorure de sodium jusqu’à 30 mM s’est avéré essentiel pour maximiser les rendements (jusqu’à 100 % de récupération). Plus récemment, Nickerson et al. ont montré que la combinaison d’une force ionique encore plus élevée (jusqu’à 100 mM) avec une température élevée (20 ° C) pendant les précipitations d’acétone donnait une récupération presque quantitative en 2-5 min25. Une légère baisse de la récupération des protéines de faible poids moléculaire (LMW) a été observée. Par conséquent, un rapport ultérieur de Baghalabadi et al. a démontré la récupération réussie des protéines et des peptides LMW (≤5 kDa) en combinant des sels spécifiques, en particulier le sulfate de zinc, avec un niveau plus élevé de solvant organique (97% d’acétone)26.
Bien que l’affinement du protocole de précipitation confère une stratégie de purification des protéines plus fiable pour la protéomique basée sur la SEP, le succès des précipitations conventionnelles repose fortement sur la technique de l’utilisateur. L’un des principaux objectifs de ces travaux est de présenter une stratégie de précipitation robuste qui facilite l’isolement de la pastille de protéine du surnageant contaminant. Une cartouche de filtration jetable a été développée pour éliminer le pipetage en isolant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane poreuse en PTFE27. Les composants interférants de la SEP dans le surnageant sont efficacement éliminés lors d’une étape de centrifugation courte et à basse vitesse. La cartouche filtrante jetable offre également une cartouche SPE interchangeable, qui facilite le nettoyage ultérieur des échantillons après laolubilisation et la digestion facultative des protéines, avant la spectrométrie de masse.
Une série de flux de travail recommandés pour la précipitation du protéome sont présentés ici, y compris les protocoles modifiés acétone et chloroforme/méthanol/eau28 , dans un format conventionnel (à base de flacons) et semi-automatisé dans une cartouche de filtration et d’extraction jetable à deux états. Les récupérations de protéines et l’efficacité de l’épuisement des FDS qui en résultent sont mises en évidence, ainsi que la couverture ascendante du protéome LC-MS/MS, afin de démontrer le résultat attendu de chaque protocole. Les avantages et les inconvénients pratiques associés à chaque approche sont discutés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La caractérisation optimale de la SEP est obtenue lorsque la FDS résiduelle est épuisée en dessous de 10 ppm. Alors que d’autres approches, telles que le FASP et la digestion sur billes, offrent un épuisement quantitatif des FDS avec une récupération variable 31,32,33, l’objectif principal des précipitations est de maximiser la pureté et le rendement simultanément. Cela dépend de l’isolation efficace du surnagea…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. Les auteurs remercient Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) et SPARC BioCentre (Molecular Analysis) de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) pour leur contribution à l’acquisition de données sur la SP.
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
Referenzen
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
- Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
- Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
- Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
- Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
- Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
- Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
- Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
- Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
- Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
- Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
- Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
- Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
- Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
- Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
- Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
- Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
- Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
- Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
- Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
- Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
- Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
- Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
- Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, 768 (1977).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
- Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
- Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
- Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
- Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
- Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
- Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
- Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
- Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).
