작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여
Summary
이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.
Abstract
안구 질환에는 여러 투여 경로를 통한 접근성이 상대적으로 쉽기 때문에 지역 약물 전달의 매력적인 표적이 되는 광범위한 유전 유전 및 후천성 장애가 포함됩니다. 결막하(SCJ) 주사는 간단하고 안전하며 일반적으로 외래 환자 환경에서 수행되기 때문에 다른 안내 투여 경로에 비해 이점을 제공합니다. 작은 동물에서 SCJ 주사는 일반적으로 눈의 크기 때문에 수술 현미경의 도움이 필요합니다. 이전 연구는 특정 아데노 관련 바이러스(AAV) 혈청형의 SCJ 주사가 안구 표면, 눈 근육, 각막 및 시신경의 표적 형질도입을 위한 유효한 유전자 전달 전략임을 입증하여 많은 안구 질환 치료를 위한 잠재적인 접근 방식을 제공합니다.
여기에서, 프로그램가능한 주입/회수 주사기 펌프(일관되고 정확한 주입 속도 및 압력을 허용함) 및 미세주입 바늘과 결합된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주입 시스템을 사용하는 마우스 모델에서 SCJ 주입에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 주사 시스템은 또한 작은 동물에서 기질내, 전방내, 유리체내 및 망막하 주사와 같은 다른 안구내 투여 경로에 적응할 수 있습니다. 안구 유전자 요법 연구를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터의 전달이 기재되어 있지만, 본원의 프로토콜은 또한 작은 동물 모델에서 다양한 안과용 용액에 대해 적응될 수 있다. 관리 경로의 주요 실제 단계, 주입 플랫폼 설정, 주입 준비 및 직접 경험의 팁에 대해 자세히 설명합니다. 또한, 원하는 조직으로의 AAV 전달 확인을 위한 일반적인 검증 기술도 간략하게 논의될 것이다.
Introduction
안구 질환은 광범위한 유전 및 후천성 질환을 포함합니다. 2015년에는 전 세계적으로 약 3,600만 명이 법적으로 시각 장애가 있었고 10억 명이 넘는 사람들이 적어도 일정 수준의 시각 장애를 앓고 있어모든 수준에서 완화 노력을 확대해야 할 필요성이 강조되었습니다1. 안구 약물을 전달하는 주요 방법에는 점안액 또는 결막하 (SCJ), 전방 내, 유리체 내 및 망막 하 주사와 같은 국소 및 국소 투여가 포함됩니다. 비침습적 국소 요법이 안과 약물의 가장 일반적인 전달 방법이며 많은 전방 분절 장애에 광범위하게 사용되지만, 각막 해부학적 장벽의 존재는 국소 투여 물질의 생체 이용률, 생체 분포 및 효능에 대한 도전을 제시하며, 이는 내안의 많은 질병에 대한 최상의 후보 치료 경로가 아닐 수 있음을 시사합니다. 질병의 영향을 받는 특정 안구 구획으로의 국소 주사는 보다 효과적이고 표적화된 약물전달 접근법일 가능성이 높습니다2. 그러나 반복 주사로 인한 부작용은 투여 전략을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이상적으로, 치료는 단일 투여 후 장기적인 치료 효능을 유지해야 합니다. 따라서, 유전자 요법은 필요한 주사의 수를 최소화하고 안구 질환 3,4의 치료를 위한 지속적인 전이유전자 발현을 제공하기 위한 유망한 옵션이다.
수많은 바이러스 및 비바이러스 벡터가 유전자 치료에 사용할 수 있습니다. 그러나 AAV 벡터는 우수한 안전성 프로파일로 인해 높은 관심을 받고 있습니다. AAV는 1965년 Atchison et al.5,6에 의해 아데노바이러스 제제의 오염 물질로 처음 발견된 작은 단일 가닥의 비외피 DNA 바이러스입니다. AAV는 이후 1980년대에 유전자 전달을 위한 효율적인 바이러스 벡터로 설계되었으며 안구 질환을 포함한 많은 질병에 대해 선택되는 유전자 치료 벡터가 되었습니다. 지난 수십 년 동안. 이들 중 가장 주목할만한 것은 희귀 후방 안과 질환 인 Leber의 선천성 Amaurosis를 치료하기 위해 미국 식품의 약국 (FDA)의 승인을 받은 최초의 상업적으로 이용 가능한 유전자 치료 약물 인 voretigene neparvovec입니다. 보레티진 네파보벡이 임상 개발의 장벽을 성공적으로 극복했지만 추가적인 안구 유전자 요법의 상용화에 대한 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, voretigene neparvovec은 망막 하 주사를 통해 생존 가능한 망막 세포를 보유하는 환자에게 투여됩니다. 따라서 생존 가능한 망막 세포가 부족한 더 진행된 형태의 질병을 가진 환자는 임상 적 이점을 제공하지 않기 때문에 치료를받을 자격이 없습니다. 또한 눈 염증, 백내장, 망막 파열, 황반 병증 및 통증 7,8을 포함하여 망막 하 주사 절차와 관련된 알려진 합병증이 관찰되었습니다. 이 절차와 관련된 다른 우려 사항으로는 출혈, 망막 박리, 안구 내염 및 안구 조직 파괴를 통한 안구 면역 특권 상태의 취소 가능성이 있습니다 9,10,11,12. 따라서, SCJ 주사와 같은 덜 침습적인 유전자 전달 경로를 탐구하려는 노력이 점점 더 중요해지고 있다 13,14,15,16,17.
결막은 3-5 층의 세포를 포함하고 앞쪽 눈을 내부 눈꺼풀에 연결하는 얇은 막입니다. SCJ 주사는 연령 관련 황반 변성, 녹내장, 망막염 및 후방 포도막염과 같은 안구 질환의 치료를 위해 눈의 전방 및/또는 후방 부분 모두에 안과 약물 전달을 위해 임상적으로 사용됩니다18,19. 이들은 수행하기가 비교적 간단하고, 외래 환자 환경(20)에서 안과 약물 전달을 위해 일상적으로 사용되며, 다소 통증이 없고, 안구 면역 특권을 손상시키지 않으며, 투여된 약물이 시신경을 둘러싸는 넓은 안와 주위 영역을 통해 확산되도록 한다. 따라서 SCJ 주사는 AAV 유전자 치료 응용 분야에 매력적인 투여 경로입니다. 마우스에서 SCJ 주사를 통해 투여된 천연 AAV 혈청형은 이전에 안전성, 형질도입 효율, 혈청 면역원성, 생체분포 및 조직 특이성13,16,21에 대해 특성화되었다. 이러한 데이터는 SCJ 투여를 통한 개별 안구 조직으로의 유전자 전달이 공식적인 가능성임을 입증했습니다.
이 백서에서는 마우스 모델에서 AAV 벡터를 전달하기 위한 SCJ 주입을 위한 간단하고 적응 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법의 재현성을 보장하기 위해 실체 현미경, 프로그래밍 가능한 주입/회수 주사기 펌프(일관되고 정확한 주입 속도 및 압력 허용) 및 미세 주입 바늘과 결합된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주입 시스템이 설명됩니다. 이 시스템은 작은 동물의 기질 내, 전방 내, 유리체 내 및 망막 하 주사와 같은 다른 안내 내 투여 경로에 적용 할 수 있습니다. 또한, 플루오레세인 염료는 종종 AAV 주사 부위의 시각화를 허용하기 위해 활용된다. 관리 경로의 주요 실제 단계, 주입 플랫폼 설정, 주입 준비 및 직접 경험의 팁에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 원하는 조직으로의 AAV 전달을 확인하기 위한 일반적인 검증 기술에 대해 간략하게 논의할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV 매개 유전자 치료는 안구 질환 치료에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 현재의 안구 유전자 치료는 두 가지 주요 국소 투여 경로인 유리체내 및 망막하 주사에 의존합니다. 불행히도 두 경로 모두 침습적이며 망막 박리, 백내장 형성 및 안구내염을 포함한 심각한 합병증을 유발할 수 있습니다. 따라서 SCJ 주사와 같이 상대적으로 덜 침습적 인 경로에 대한 조사는 큰 관심사입니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 연구에 사용된 scAAV8-GFP 벡터를 제공한 노스캐롤라이나 대학의 벡터 코어, CGIBD 조직학 코어, 이 연구의 임상 평가 측면에 도움을 준 Brian C. Gilger 박사의 실험실에 감사드립니다. 이 연구는 Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship과 American Society of Gene & Cell Therapy 및 Cystic Fibrosis Foundation의 경력 개발 상을 수상했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 American Society of Gene & Cell Therapy 또는 Cystic Fibrosis Foundation의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
Referenzen
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch’s layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
