كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات خارج الخلية عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة
Summary
يوضح البروتوكول هنا أنه يمكن فصل الحويصلات خارج الخلية بشكل كاف عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل مرتبطة بالغشاء الدهني بحجم النانو يتم إطلاقها من جميع الخلايا ، وهي موجودة في جميع السوائل الحيوية ، وتحتوي على بروتينات وأحماض نووية ودهون تعكس الخلية الأم التي تشتق منها. يسمح الفصل السليم للمركبات الكهربائية عن المكونات الأخرى في العينة بتوصيف البضائع المرتبطة بها ويضفي نظرة ثاقبة على إمكاناتها كجهات اتصال بين الخلايا ومؤشرات حيوية غير غازية للعديد من الأمراض. في الدراسة الحالية ، تم عزل المركبات الكهربائية المشتقة من oligodendrocyte من وسائط زراعة الخلايا باستخدام مزيج من أحدث التقنيات ، بما في ذلك الترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لفصل EVs عن البروتينات الأخرى خارج الخلية ومجمعات البروتين. باستخدام أعمدة SEC المتاحة تجاريا ، تم فصل EVs عن البروتينات خارج الخلية التي تم إطلاقها من خلايا oligodendroglioma البشرية تحت ظروف الإجهاد الضابطة والشبكة الإندوبلازمية (ER). لوحظت علامات EV الأساسية CD9 و CD63 و CD81 في الكسور 1-4 ، ولكن ليس في الكسور 5-8. تم استخدام GM130 ، وهو بروتين من جهاز Golgi ، و calnexin ، وهو بروتين متكامل من ER ، كعلامات EV سلبية ، ولم يتم ملاحظتها في أي جزء. علاوة على ذلك ، عند تجميع وتركيز الكسور 1-4 ككسر EV ، والكسور 5-8 ككسر البروتين ، لوحظ التعبير عن CD63 و CD81 و CD9 في جزء EV. لم يلاحظ التعبير عن GM130 أو calnexin في أي من أنواع الكسور. تم تصور الكسور المجمعة من كل من ظروف التحكم وإجهاد ER باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ولوحظت الحويصلات في كسور EV ، ولكن ليس في أجزاء البروتين. كما تم قياس الجسيمات الموجودة في أجزاء EV والبروتين من كلتا الحالتين كميا باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية. معا ، تظهر هذه البيانات أن SEC هي طريقة فعالة لفصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة.
Introduction
وقد ترافق انفجار الاهتمام بدراسة الحويصلات خارج الخلية (EVs) مع تطورات كبيرة في التقنيات والتقنيات المستخدمة لفصل ودراسة هذه الجسيمات غير المتجانسة ذات الحجم النانوي. في الوقت منذ اكتشافها منذ ما يقرب من أربعة عقود 1,2 ، تم العثور على هذه الهياكل الغشائية الصغيرة التي تحتوي على الدهون النشطة بيولوجيا والأحماض النووية والبروتينات ، وتلعب أدوارا رئيسية في التواصل بين الخلايا 3,4. يتم إطلاق EVs من جميع أنواع الخلايا وبالتالي فهي موجودة في جميع السوائل البيولوجية ، بما في ذلك بلازما الدم والمصل واللعاب والبول. تحمل المركبات الكهربائية داخل هذه السوائل وعدا كبيرا لتكون بمثابة مؤشرات حيوية غير غازية لمختلف الأمراض ، بما في ذلك الأمراض العصبية الالتهابية والتنكسية العصبية والسرطانات واضطرابات المناعة الذاتية5،6،7. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء الدراسات الميكانيكية في المختبر من خلال تقنيات زراعة الخلايا عن طريق فصل المركبات الكهربائية التي يتم إطلاقها في وسط الثقافة3،8،9.
لفهم دور المركبات الكهربائية في الفيزيولوجيا المرضية للمرض ، فإن الفصل الكافي عن السائل الذي توجد فيه أمر بالغ الأهمية. لطالما كان المعيار الذهبي لفصل المركبات الكهربائية هو الطرد المركزي التفاضلي (dUC)10 ، ومع ذلك فقد نشأت تقنيات أكثر تطورا لتحقيق فصل أفضل للمركبات الكهربائية عن المكونات الأخرى خارج الخلية. وتشمل بعض هذه التقنيات تدرجات الكثافة، وجزء التدفق الميداني غير المتماثل (A4F)، وقياس التدفق الخلوي، والالتقاط المناعي، وهطول الأمطار من البولي إيثيلين غليكول، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) 11،12،13. كل تقنية لها مجموعة خاصة بها من المزايا والعيوب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن SEC على وجه الخصوص يفصل المركبات الكهربائية عن كل من السوائل البيولوجية وsupernatants زراعة الخلايا بشكل فعال للغاية8،14،15. لدى SEC أيضا مكافأة إضافية تتمثل في كونها مباشرة نسبيا وسهلة الاستخدام.
SEC هي طريقة تفصل مكونات السائل بناء على الحجم. باستخدام هذه التقنية ، يتم استخدام عمود من الراتنج (إما مصنوع داخليا أو يتم شراؤه تجاريا) لتجزئة العينة. يتم احتجاز الجسيمات الصغيرة في العينة بين الخرز داخل الراتنج ، في حين أن الجسيمات الأكبر قادرة على المرور عبر الراتنج بحرية أكبر ، وبالتالي تتلاشى في وقت مبكر من العملية. نظرا لأن المركبات الكهربائية أكبر حجما من العديد من البروتينات خارج الخلية ومجاميع البروتينات ، فإن المركبات الكهربائية تمر عبر العمود بشكل أسرع وتضعف في أجزاء سابقة من البروتينات خارج الخلية14.
في ورقة الأساليب هذه ، يتم تحديد استخدام SEC لفصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا (CCM) من الخلايا قليلة التغصن البشرية تحت كل من ظروف الإجهاد الرقابي والشبكة الإندوبلازمية (ER). باستخدام هذا البروتوكول ، تبين أن المركبات الكهربائية المنفصلة بهذه التقنية موجودة داخل أجزاء محددة يمكن تجميعها معا وتركيزها للتوصيف النهائي ، وأن المركبات الكهربائية المنفصلة مشتقة من الخلايا وليس من مصدر خارجي مثل مصل البقر الجنيني (FBS) المستخدم لتكملة CCM. يظهر وجود علامات EV الأساسية ، CD63 و CD81 و CD916،17،18،19 في كسور EV ، وغيابها في كسور البروتين مع النشاف الغربي. باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، يتم تصور EVs وعرض المورفولوجيا المتوقعة ويتم ملاحظتها فقط في جزء EV. يتم حساب الجسيمات أيضا في أجزاء EV والبروتين في كل من ظروف الإجهاد الضابطة و ER ، ويلاحظ عدد كبير من الجسيمات ضمن نطاق الحجم المتوقع الذي يتراوح قطره بين 50-200 نانومتر في عينات EV. تدعم هذه البيانات معا فكرة أن SEC هي طريقة فعالة وفعالة لفصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC هي طريقة سهلة الاستخدام لفصل EVs بشكل كاف عن CCM المشروطة. من أجل عزل المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا على وجه التحديد ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار بعناية نوع CCM وملحقاته. تحتاج العديد من وسائط زراعة الخلايا إلى استكمالها ب FBS ، والتي تحتوي على EVs مشتقة من الحيوان الذي تم حصاد المصل فيه. قد …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا ولاية بنسلفانيا بيرند ومؤسسة هاموت الصحية على التمويل ، وكذلك مرفق الفحص المجهري لولاية بنسلفانيا في يونيفرسيتي بارك ، بنسلفانيا.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
Referenzen
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
- Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
- Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
- O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
- Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
- Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
- Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
- Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
- Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
- Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
- Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
