In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.
Periphere Neuropathien können als Folge einer axonalen Schädigung und gelegentlich aufgrund von demyelinisierenden Erkrankungen auftreten. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das bei 1,5 % bis 5 % der Notfallpatienten auftritt und zu erheblichen Arbeitsplatzverlusten führen kann. Heute sind auf Tissue Engineering basierende Ansätze, die aus Gerüsten, geeigneten Zelllinien und Biosignalen bestehen, mit der Entwicklung dreidimensionaler (3D) Bioprinting-Technologien anwendbarer geworden. Die Kombination verschiedener Hydrogel-Biomaterialien mit Stammzellen, Exosomen oder Biosignalmolekülen wird häufig untersucht, um die bestehenden Probleme bei der peripheren Nervenregeneration zu überwinden. Dementsprechend hat die Herstellung von injizierbaren Systemen, wie z.B. Hydrogelen, oder implantierbaren Conduit-Strukturen, die durch verschiedene Bioprinting-Methoden gebildet werden, im peripheren Neuro-Engineering an Bedeutung gewonnen. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Dabei handelt es sich nicht um spezialisierte Zellen, sondern sie können sich bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren. Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Bei peripheren Nervenverletzungen, insbesondere bei Neurotmesis, kann dieses Mikromilieu auch nach chirurgischer Bindung durchtrennter Nervenenden nicht vollständig gerettet werden. Der Ansatz von Verbundbiomaterialien und kombinierten zellulären Therapien erhöht die Funktionalität und Anwendbarkeit von Materialien in Bezug auf verschiedene Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Verarbeitbarkeit. Dementsprechend zielt diese Studie darauf ab, die Herstellung und Verwendung von Graphen-basiertem biohybridem Hydrogel-Patterning zu demonstrieren und die Differenzierungseffizienz von Stammzellen zu Nervenzellen zu untersuchen, was eine effektive Lösung bei der Nervenregeneration sein kann.
Das Nervensystem, der Mechanismus, der die innere Struktur des Organismus und die Umwelt verbindet, ist in zwei Teile unterteilt: das zentrale und das periphere Nervensystem. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das 1,5 % bis 5 % der Patienten ausmacht, die sich in der Notaufnahme vorstellen und sich aufgrund verschiedener Traumata entwickeln, was zu einem erheblichen Verlust des Arbeitsplatzes führt 1,2,3.
Heute sind zelluläre Ansätze des peripheren Neuro-Engineerings von großem Interesse. Stammzellen stehen bei diesen Ansätzen an erster Stelle. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Diese Zellen sind spezialisiert, können sich aber bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren 4,5. Nach der Stammzellhypothese steht das Stammzellsystem unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Die Konservierung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne das Vorhandensein ihrer Mikroumgebung6 nicht möglich, die durch Tissue Engineering mit Hilfe von Zellen und Scaffolds7 rekonstituiert werden kann. Tissue Engineering ist ein multidisziplinäres Gebiet, das sowohl ingenieurwissenschaftliche als auch biologische Prinzipien umfasst. Tissue Engineering bietet Werkzeuge für die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann und bei der Regeneration dieses Gewebes verwendet werden kann, indem das beschädigte Gewebe entfernt und funktionsfähiges Gewebe bereitgestellt wird8. Gewebegerüste, einer der drei Eckpfeiler des Tissue Engineering, werden mit unterschiedlichen Methoden aus natürlichen und synthetischen Materialien hergestellt9. Der dreidimensionale (3D) Druck ist eine aufstrebende additive Fertigungstechnologie, die häufig eingesetzt wird, um defektes Gewebe durch die einfache, aber vielseitige Herstellung komplexer Formen mit verschiedenen Methoden zu ersetzen oder wiederherzustellen. Bioprinting ist ein additives Fertigungsverfahren, das die Koexistenz von Zellen und Biomaterialien ermöglicht, sogenannte Biotinten10. Unter Berücksichtigung der Interaktion von Nervenzellen untereinander haben sich die Studien auf leitfähige Biomaterialkandidaten wie Graphen verlagert. Graphen-Nanoplatten, die Eigenschaften wie flexible Elektronik, Superkondensatoren, Batterien, Optiken, elektrochemische Sensoren und Energiespeicherung aufweisen, sind ein bevorzugtes Biomaterial im Bereich des Tissue Engineering11. Graphen wurde in Studien verwendet, in denen die Proliferation und Regeneration von geschädigten Geweben und Organen durchgeführt wurde12,13.
Tissue Engineering besteht aus drei Grundbausteinen: Gerüst, Zellen und Biosignalmoleküle. Es gibt Defizite in den Studien zur peripheren Nervenschädigung in Bezug auf die vollständige Bereitstellung dieser drei Strukturen. Bei den in den Studien hergestellten und verwendeten Biomaterialien sind verschiedene Probleme aufgetreten, wie z. B. dass sie nur Stammzellen oder Biosignalmoleküle enthalten, das Fehlen eines bioaktiven Moleküls, das die Differenzierung von Stammzellen ermöglicht, die mangelnde Biokompatibilität des verwendeten Biomaterials und die geringe Auswirkung auf die Proliferation von Zellen in der Gewebenische. und somit wird die Nervenleitung nicht vollständig realisiert 2,13,14,15,16. Dies erfordert die Optimierung der Nervenregeneration, die Verringerung des Muskelschwunds 17,18 und die Schaffung der notwendigen Zielsuche19 mit Wachstumsfaktoren gegen solche Probleme. An dieser Stelle ist die Charakterisierung und Analyse der Neuroaktivität eines chirurgischen Biomaterial-Prototyps, der in die Klinik übertragen werden soll, sehr wichtig.
Dementsprechend untersucht diese Methodenstudie die Biotinten-Hydrogel-Strukturierung mit Graphen-Nanoplatten, die von einem 3D-Biodrucker gebildet werden, und ihre Wirksamkeit auf die neurogene Differenzierung der darin enthaltenen Stammzellen. Außerdem werden die Auswirkungen von Graphen auf die Bildung und Differenzierung von Neurosphären untersucht.
Die Vorteile von Behandlungen, die mit technischen 3D-Gerüsten gegenüber herkömmlichen 2D-Methoden angewendet werden, werden von Tag zu Tag deutlicher. Stammzellen, die allein in diesen Therapien oder zusammen mit Gerüsten aus verschiedenen Biomaterialien mit geringer Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden, sind in der Regel unzureichend für die periphere Nervenregeneration. Die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs) scheinen eine geeignete Kandidatenzelllinie zu sein, in…
The authors have nothing to disclose.
Das in dieser Studie verwendete Graphen wurde an der Kirklareli University, Fakultät für Maschinenbau, entwickelt. Es wurde von Dr. Karabeyoğlu gespendet. Finanziert wurde der Graphen-Toxizitätstest durch das Projekt “Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks” (Antrags-Nr.: 1139B411802273), das im Rahmen des TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program durchgeführt wurde. Der andere Teil der Studie wurde durch den Forschungsfonds der Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713) unterstützt. Mesenchymale Stammzellen mit GFP, die in der Zeitraffer-Bildgebung verwendet wurden, wurden von Virostem Biotechnology gespendet. Die Autoren danken dem Darıcı LAB und dem YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB Team für die produktiven Diskussionen.
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |