Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

Summary

In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.

Abstract

Periphere Neuropathien können als Folge einer axonalen Schädigung und gelegentlich aufgrund von demyelinisierenden Erkrankungen auftreten. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das bei 1,5 % bis 5 % der Notfallpatienten auftritt und zu erheblichen Arbeitsplatzverlusten führen kann. Heute sind auf Tissue Engineering basierende Ansätze, die aus Gerüsten, geeigneten Zelllinien und Biosignalen bestehen, mit der Entwicklung dreidimensionaler (3D) Bioprinting-Technologien anwendbarer geworden. Die Kombination verschiedener Hydrogel-Biomaterialien mit Stammzellen, Exosomen oder Biosignalmolekülen wird häufig untersucht, um die bestehenden Probleme bei der peripheren Nervenregeneration zu überwinden. Dementsprechend hat die Herstellung von injizierbaren Systemen, wie z.B. Hydrogelen, oder implantierbaren Conduit-Strukturen, die durch verschiedene Bioprinting-Methoden gebildet werden, im peripheren Neuro-Engineering an Bedeutung gewonnen. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Dabei handelt es sich nicht um spezialisierte Zellen, sondern sie können sich bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren. Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Bei peripheren Nervenverletzungen, insbesondere bei Neurotmesis, kann dieses Mikromilieu auch nach chirurgischer Bindung durchtrennter Nervenenden nicht vollständig gerettet werden. Der Ansatz von Verbundbiomaterialien und kombinierten zellulären Therapien erhöht die Funktionalität und Anwendbarkeit von Materialien in Bezug auf verschiedene Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Verarbeitbarkeit. Dementsprechend zielt diese Studie darauf ab, die Herstellung und Verwendung von Graphen-basiertem biohybridem Hydrogel-Patterning zu demonstrieren und die Differenzierungseffizienz von Stammzellen zu Nervenzellen zu untersuchen, was eine effektive Lösung bei der Nervenregeneration sein kann.

Introduction

Das Nervensystem, der Mechanismus, der die innere Struktur des Organismus und die Umwelt verbindet, ist in zwei Teile unterteilt: das zentrale und das periphere Nervensystem. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das 1,5 % bis 5 % der Patienten ausmacht, die sich in der Notaufnahme vorstellen und sich aufgrund verschiedener Traumata entwickeln, was zu einem erheblichen Verlust des Arbeitsplatzes führt ^1,2,3.

Heute sind zelluläre Ansätze des peripheren Neuro-Engineerings von großem Interesse. Stammzellen stehen bei diesen Ansätzen an erster Stelle. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Diese Zellen sind spezialisiert, können sich aber bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren ^4,5. Nach der Stammzellhypothese steht das Stammzellsystem unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Die Konservierung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne das Vorhandensein ihrer Mikroumgebung⁶ nicht möglich, die durch Tissue Engineering mit Hilfe von Zellen und Scaffolds⁷ rekonstituiert werden kann. Tissue Engineering ist ein multidisziplinäres Gebiet, das sowohl ingenieurwissenschaftliche als auch biologische Prinzipien umfasst. Tissue Engineering bietet Werkzeuge für die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann und bei der Regeneration dieses Gewebes verwendet werden kann, indem das beschädigte Gewebe entfernt und funktionsfähiges Gewebe bereitgestellt wird⁸. Gewebegerüste, einer der drei Eckpfeiler des Tissue Engineering, werden mit unterschiedlichen Methoden aus natürlichen und synthetischen Materialien hergestellt⁹. Der dreidimensionale (3D) Druck ist eine aufstrebende additive Fertigungstechnologie, die häufig eingesetzt wird, um defektes Gewebe durch die einfache, aber vielseitige Herstellung komplexer Formen mit verschiedenen Methoden zu ersetzen oder wiederherzustellen. Bioprinting ist ein additives Fertigungsverfahren, das die Koexistenz von Zellen und Biomaterialien ermöglicht, sogenannte Biotinten¹⁰. Unter Berücksichtigung der Interaktion von Nervenzellen untereinander haben sich die Studien auf leitfähige Biomaterialkandidaten wie Graphen verlagert. Graphen-Nanoplatten, die Eigenschaften wie flexible Elektronik, Superkondensatoren, Batterien, Optiken, elektrochemische Sensoren und Energiespeicherung aufweisen, sind ein bevorzugtes Biomaterial im Bereich des Tissue Engineering¹¹. Graphen wurde in Studien verwendet, in denen die Proliferation und Regeneration von geschädigten Geweben und Organen durchgeführt wurde^12,13.

Tissue Engineering besteht aus drei Grundbausteinen: Gerüst, Zellen und Biosignalmoleküle. Es gibt Defizite in den Studien zur peripheren Nervenschädigung in Bezug auf die vollständige Bereitstellung dieser drei Strukturen. Bei den in den Studien hergestellten und verwendeten Biomaterialien sind verschiedene Probleme aufgetreten, wie z. B. dass sie nur Stammzellen oder Biosignalmoleküle enthalten, das Fehlen eines bioaktiven Moleküls, das die Differenzierung von Stammzellen ermöglicht, die mangelnde Biokompatibilität des verwendeten Biomaterials und die geringe Auswirkung auf die Proliferation von Zellen in der Gewebenische. und somit wird die Nervenleitung nicht vollständig realisiert 2,13,14,15,16. Dies erfordert die Optimierung der Nervenregeneration, die Verringerung des Muskelschwunds ^17,18 und die Schaffung der notwendigen Zielsuche¹⁹ mit Wachstumsfaktoren gegen solche Probleme. An dieser Stelle ist die Charakterisierung und Analyse der Neuroaktivität eines chirurgischen Biomaterial-Prototyps, der in die Klinik übertragen werden soll, sehr wichtig.

Dementsprechend untersucht diese Methodenstudie die Biotinten-Hydrogel-Strukturierung mit Graphen-Nanoplatten, die von einem 3D-Biodrucker gebildet werden, und ihre Wirksamkeit auf die neurogene Differenzierung der darin enthaltenen Stammzellen. Außerdem werden die Auswirkungen von Graphen auf die Bildung und Differenzierung von Neurosphären untersucht.

Protocol

1. Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees Nehmen Sie die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs, aus ATCC) aus einem −80 °C heißen Gefrierschrank. Kultivieren Sie WJ-MSCs in DMEM-F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum (FBS), 1 % Pen-Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, in einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur, wie in Yurie et al.20 beschrieben. Kryokonservieren Sie einige der Zellen bei 1 x 106…

Representative Results

Graphen-Toxizität und 2D-BildgebungDie statistische Analyse der erhaltenen MTT-Ergebnisse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test in einer statistischen Analysesoftware durchgeführt, und die erhaltene Grafik ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graphenanteil im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte nur für die Graphenkonzentration von 0,001 % (**p < 0,01) eine signifikante Abnahme. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gru…

Discussion

Die Vorteile von Behandlungen, die mit technischen 3D-Gerüsten gegenüber herkömmlichen 2D-Methoden angewendet werden, werden von Tag zu Tag deutlicher. Stammzellen, die allein in diesen Therapien oder zusammen mit Gerüsten aus verschiedenen Biomaterialien mit geringer Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden, sind in der Regel unzureichend für die periphere Nervenregeneration. Die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs) scheinen eine geeignete Kandidatenzelllinie zu sein, in…

Materials

Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process