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Biotechnik

Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette

Published: May 04, 2022
doi:
10.3791/63672
, , , ,
1Department of Chemical Engineering,University of Mississippi, 2Department of Biomedical Engineering,University of Mississippi

Summary

Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.

Abstract

Myosine sind Motorproteine, die ATP hydrolysieren, um entlang der Spuren des Aktinfilaments (AF) zu treten, und sind essentiell für zelluläre Prozesse wie Motilität und Muskelkontraktion. Um ihre krafterzeugenden Mechanismen zu verstehen, wurde Myosin II sowohl auf Einzelmolekülebene (SM) als auch als Motorteams in vitro mit biophysikalischen Methoden wie optischem Trapping untersucht.

Diese Studien zeigten, dass sich das Verhalten der Myosinkrafterzeugung stark unterscheiden kann, wenn man von der Einzelmolekülebene in einer Drei-Perlen-Anordnung zu Gruppen von Motoren übergeht, die auf einer starren Perlen- oder Deckglasoberfläche in einer Gleitanordnung zusammenarbeiten. Diese Assay-Konstruktionen erlauben es jedoch nicht, die Gruppendynamik von Myosin innerhalb der viskoelastischen Strukturhierarchie zu bewerten, wie dies innerhalb einer Zelle der Fall wäre. Wir haben eine Methode mit optischen Pinzetten entwickelt, um die Mechanik der Krafterzeugung durch Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit mehreren Aktinfilamenten interagieren.

Diese Actomyosin-Bündel erleichtern die Untersuchung in einer hierarchischen und konformen Umgebung, die die motorische Kommunikation und die Ensemblekraftabgabe erfasst. Die anpassbare Natur des Assays ermöglicht es, experimentelle Bedingungen zu ändern, um zu verstehen, wie Modifikationen am Myosin-Ensemble, Aktinfilamentbündel oder der Umgebung zu unterschiedlichen Kraftausgängen führen.

Introduction

Motorproteine sind lebenswichtig und wandeln chemische Energie in mechanische Arbeit um 1,2,3. Myosinmotoren interagieren mit Aktinfilamenten, indem sie Schritte entlang der Filamente ähnlich einer Spur machen, und die Dynamik von Aktin-Myosin-Netzwerken führt unter anderem Muskelkontraktion, Zellmotilität, den kontraktilen Ring während der Zytokinese und die Bewegung der Fracht innerhalb der Zelle durch 3,4,5,6,7,8 . Da Myosine so viele wesentliche Rollen spielen, kann ein Versagen der Funktionalität des Myosin-Aktin-Netzwerks zur Entwicklung von Krankheiten führen, wie z.B. Mutationen in der Myosin-Schwerkette, die eine Herzhyperkontraktilität bei hypertropher Kardiomyopathie (HCM) verursachen9,10,11,12,13,14 . Bei der Muskelkontraktion kooperieren einzelne Myosinmotoren, indem sie als Ensemble zusammenarbeiten, um die erforderliche mechanische Energie bereitzustellen, die das relative Gleiten der AFs 4,15,16,17,18 ausführt. Myosinmotoren bilden Querbrücken zwischen AFs und nutzen Konformationsänderungen aufgrund ihres mechanochemischen Zyklus, um sich kollektiv zum Stachelende der ausgerichteten Filamente 17,18,19,20,21 zu bewegen.

Die Entwicklung quantitativer In-vitro-Motilitätsassays auf SM-Ebene unter Verwendung von Techniken wie optischem Trapping hat es ermöglicht, beispiellose Details über die Funktionsweise einzelner Myosinmotoren zu sammeln, einschließlich der Messung der SM-Krafterzeugung und der Schrittgrößen 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. entwickelten den optischen Fallenassay “Drei-Perle” oder “Hantel”, um die Krafterzeugungsmechanik einzelner Myosin-II-Motoren23,31 zu untersuchen. Da Muskelmyosin II in Teams arbeitet, um AFs zu kontrahieren, aber auf SM-Ebene nicht prozessiv ist, musste die Ausrichtung des optischen Fangassays vom klassischen motorgebundenen Perlenansatz32 neu angeordnet werden. Um den Hanteltest zu bilden, wurden zwei optische Fallen verwendet, um einen AF über einem Myosinmotor zu halten, der an eine an einem Deckglas befestigte Perle gebunden war, und die Kraftabgabe durch den einzelnen Motor wurde durch Bewegungen des AF innerhalb der Falle23 gemessen.

SM-Kräfte und die Verwendung einer Einzelmotor-/Einzelfilament-Assay-Orientierung geben jedoch kein vollständiges Bild über die Krafterzeugung auf Systemebene, da viele Motorproteine, einschließlich Myosin II, nicht isoliert arbeiten und oft nicht als Summe ihrer Teile funktionieren 15,16,17,32,33,34,35,36 . Komplexere Strukturen, die mehr als einen Motor umfassen, der mit mehr als einem Filament interagiert, sind notwendig, um die Synergie von Myosin- und Aktinfilament-Netzwerken besser zu verstehen15,32. Die Hantel-Assay-Orientierung wurde ausgenutzt, um die Erzeugung kleiner Ensemblekräfte zu untersuchen, indem mehrere Myosine an einer Perle befestigt sind oder ein Myosin-dickes Filament an einer Oberfläche befestigt ist und die Motoren mit dem hängenden AF 4,23,34,37,38,39,40 interagieren können.

Andere kleine Ensemble-Assays umfassen einen In-vitro-Filament-Gleitassay, bei dem Myosinmotoren auf eine Deckglasoberfläche beschichtet werden und eine an einen AF gebundene Perle verwendet wird, um die vom Motorteam erzeugte Kraft zu untersuchen 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In beiden Fällen sind die Myosine an eine starre Oberfläche – Perle oder Deckglas – gebunden und verwenden einen AF. In diesen Fällen sind die Motoren nicht in der Lage, sich frei zu bewegen oder miteinander zu kommunizieren, noch spiegelt die starre Bindung von Myosinen die nachgiebige, hierarchische Umgebung wider, in der die Motoren im Sarkomerzusammenarbeiten würden 32. Frühere Studien haben gezeigt, dass Myosin II seine Umgebung wahrnehmen und sich entsprechend an sich ändernde viskoelastische oder motorische Konzentrationsbedingungen anpassen kann, indem Eigenschaften wie Krafterzeugung und Tastverhältnis41,44,45 verändert werden. Daher besteht die Notwendigkeit, einen optischen Trapping-Assay zu entwickeln, der die motorische Kommunikation und Systemkonformität fördert und erfasst, um ein realistischeres Bild der mechanistischen Grundlagen der Myosin-II-Ensemblekrafterzeugung zu zeichnen.

Hier haben wir eine Methode entwickelt, um hierarchische Strukturen in vitro mit optischem Trapping zu koppeln, indem wir Actomyosin-Bündel oder Sandwiches bilden, die aus mehreren Myosinmotoren bestehen, die zwischen zwei Aktinfilamenten interagieren. Diese modulare Assay-Geometrie hat die Fähigkeit, direkt zu untersuchen, wie molekulare und Umweltfaktoren die Ensemble-Myosin-Krafterzeugung beeinflussen. Darüber hinaus hat die Untersuchung von Krafterzeugungsmechanismen durch diese Aktin-Myosin-Ensembles das Potenzial, bei der Modellierung und dem Verständnis zu helfen, wie sich großräumige zelluläre Aufgaben, wie die Muskelkontraktion, von der molekularen Ebene aus ausbreiten 9,10,13.

Protocol

1. Deckgläser ätzen 100 g KOH werden in 300 mL 100% Ethanol in einem 1.000 ml Becherglas gelöst. Mit einem Rührbalken umrühren, bis sich der Großteil der KOH aufgelöst hat.ACHTUNG: Konzentrierte KOH-Lösung kann Verbrennungen und Schäden an der Kleidung verursachen. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und einen Laborkittel. Deckgläser einzeln in Deckglas-Reinigungsgestelle legen.HINWEIS: Die Racks sind mit Schlitzen ausgestattet, die einzelne Deckgläser im Abstand hal…

Representative Results

Die Durchflusszellen, die die Actomyosin-Bündelsysteme enthalten, haben ein Standarddesign, bestehend aus einem Objektträger und einem geätzten Deckglas, das durch einen Kanal aus doppelseitigem Klebeband getrennt ist (Abbildung 1). Der Assay wird dann vom Deckglas bis zur Verwendung von abgestuften Einführungen, wie im Protokoll beschrieben, erstellt. Der endgültige Assay besteht aus Rhodamin-markierten Aktinfilamenten; die gewünschte Myosinkonzentration (1 μM wurde für die repräse…

Discussion

Eine In-vitro-Studie mit optischen Pinzetten in Kombination mit Fluoreszenzbildgebung wurde durchgeführt, um die Dynamik von Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit Aktinfilamenten interagieren. Aktin-Myosin-Aktin-Bündel wurden unter Verwendung von Muskelmyosin II, Rhodamin-Aktin an der Unterseite des Bündels und auf der Deckglasoberfläche und 488-markierten, biotinylierten Aktinfilamenten auf der Oberseite des Bündels zusammengesetzt. Aktinprotein aus Kaninchenmuskeln wurde unter Verwendung von allgemeine…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird teilweise vom University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), dem University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), dem Mississippi Space Grant Consortium unter der Fördernummer NNX15AH78H (JCW, DNR) und der American Heart Association unter der Fördernummer 848586 (DNR) unterstützt.

Materials

Actin protein (biotin): skeletal muscle Cytoskeleton AB07-A Biotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A Actin protein
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATP Fisher scientific BP413-25 Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucose Fisher scientific MP218069110 Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein) Biorad 1706404 Used to block surface from non-specific binding
CaCl2 Fisher scientific C79500 Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
Catalase Fisher scientific ICN10040280 Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Coverslips Fisher scientific 12544C Used to make flow cells
DTT Fisher scientific AC327190010 Used for buffer preparation
Ethanol Fisher scientific A4094 Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidase Fisher scientific 34-538-610KU Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KCl Fisher scientific P217-500 Used for buffer preparation
KOH Fisher scientific P250-1 Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2 Fisher scientific M33-500 Used for buffer preparation
Microscope slides Fisher scientific 12-544-2 Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscle Cytoskeleton MY02 Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2 Bruker/JPK NT2 Optical trapping instrument
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P8920 Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine Phalloidin Cytoskeleton PHDR1 Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μm Spherotech SVP-10-5 Optical trapping handle
Tris-HCl Fisher scientific PR H5121 Used for buffer preparation
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Al Azzam, O., Watts, J. C., Reynolds, J. E., Davis, J. E., Reinemann, D. N. Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (183), e63672, doi:10.3791/63672 (2022).
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