Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa
Summary
Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.
Abstract
Os astrócitos possuem um grau surpreendente de complexidade morfológica que lhes permite interagir com quase todos os tipos de células e estruturas dentro do cérebro. Através dessas interações, os astrócitos regulam ativamente muitas funções cerebrais críticas, incluindo formação de sinapse, neurotransmissão e homeostase de íon. No cérebro dos roedores, os astrócitos crescem em tamanho e complexidade durante as três primeiras semanas pós-natal e estabelecem territórios distintos e não sobrepostos para ladrilhos cerebrais. Este protocolo fornece um método estabelecido para analisar o volume do território de astrócito e astuta usando seções de tecido flutuante livre do cérebro do camundongo. Primeiro, este protocolo descreve os passos para a coleta de tecidos, criosectioning e imunostaining de seções de tecido flutuante livre. Em segundo lugar, este protocolo descreve a aquisição e análise de imagens do volume de território de astrócito e do volume de sobreposição de território, utilizando software de análise de imagem comercialmente disponível. Por fim, este manuscrito discute as vantagens, considerações importantes, armadilhas comuns e limitações desses métodos. Este protocolo requer tecido cerebral com rotulagem fluorescente esparsa ou mosaico de astrócitos, e foi projetado para ser usado com equipamentos de laboratório comuns, microscopia confocal e software de análise de imagem comercialmente disponível.
Introduction
Os astrócitos são células elaboradas que desempenham muitas funções importantes no cérebro1. No córtex do camundongo, as células-tronco gliais radiais dão origem a astrócitos durante os estágios pós-nataltardios e iniciais 2. Durante as três primeiras semanas pós-natal, os astrócitos crescem em tamanho e complexidade, desenvolvendo milhares de ramos finos que interagem diretamente com as sinapses1. Simultaneamente, os astrócitos interagem com os astrócitos vizinhos para estabelecer territórios discretos e não sobrepostos para ladrilhos cerebrais3, mantendo a comunicação através dos canais de junção4. Morfologia e organização de astrócitos são interrompidas em muitos estados da doença após insulto ou lesão5, indicando a importância desses processos para a função cerebral adequada. A análise das propriedades morfológicas de astrócitos durante o desenvolvimento normal, o envelhecimento e a doença podem fornecer insights valiosos sobre biologia astrócito e fisiologia. Além disso, a análise da morfologia astrócito após a manipulação genética é uma ferramenta valiosa para discernir os mecanismos celulares e moleculares que regem o estabelecimento e a manutenção da complexidade morfológica de astrócito.
A análise da morfologia de astrócitos no cérebro do camundongo é complicada tanto pela complexidade de ramificação de astrócito quanto por tiling de astrócito. A coloração de anticorpos usando a proteína ácida fibrilara fibrilara glicial (GFAP) de filamento intermediário como marcador específico de astrócito captura apenas os principais ramos, e subestima vastamente a complexidade morfológica de astrócito1. Outros marcadores específicos de células como o transportador de glutamato 1 (GLT-1; slc1a2), a sisíntese de glutamina ou S100β fazem um trabalho melhor de rotulagem de ramos de astrócito6, mas introduzem um novo problema. Os territórios de astrócitos não são em grande parte sobrepostos, mas um pequeno grau de sobreposição existe nas bordas periféricas. Devido à complexidade do ramo, quando os astrócitos vizinhos são rotulados da mesma cor, é impossível distinguir onde um astrócito termina e o outro começa. A rotulagem esparsa ou mosaico de astrócitos com proteínas fluorescentes endógenas resolve ambos os problemas: o marcador fluorescente enche a célula para capturar todos os ramos e permite imagens de astrócitos individuais que podem ser distinguidos de seus vizinhos. Várias estratégias diferentes têm sido usadas para alcançar rotulagem fluorescente esparsa de astrócitos, com ou sem manipulação genética, incluindo injeção viral, eletroporação plasmida ou linhas de camundongos transgênicos. Detalhes sobre a execução dessas estratégias estão descritos em estudos e protocolos publicados anteriormente 1,7,8,9,10,11,12,13.
Este artigo descreve um método para medir o volume de território de astrócito a partir de cérebros de camundongos com rotulagem fluorescente em uma população esparsa de astrócitos (Figura 1). Como o diâmetro médio de um astrócito no córtex do rato é de aproximadamente 60 μm, seções de 100 μm de espessura são usadas para melhorar a eficiência na captura de astrócitos individuais em sua totalidade. A imunostaining não é necessária, mas é recomendado para melhorar o sinal fluorescente endógeno para imagens e análises confocal. A imunostaining também pode permitir uma melhor detecção de ramos de astrócitos finos e reduzir o fotobleaching de proteínas endógenas durante a aquisição de imagens. Para melhorar a penetração de anticorpos nas seções grossas e para preservar o volume de tecido da seção através da imagem, são utilizadas seções de tecido flutuante livre. A análise do volume de território de astrócito é realizada utilizando-se software de análise de imagem comercialmente disponível. Além disso, este protocolo descreve um método de análise de revestimento de astrócito em seções de tecido com rotulagem de mosaico, onde os astrócitos vizinhos expressam diferentes rótulos fluorescentes. Este protocolo tem sido usado com sucesso em vários estudos recentes 1,8,9 para caracterizar o crescimento de astrócitos durante o desenvolvimento cerebral normal, bem como o impacto da manipulação genética no desenvolvimento de astrócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método estabelecido para analisar o volume do território de astrócito e astúcia no córtex do rato, detalhando todos os principais passos que começam com a perfusão e terminam com a análise de imagem. Este protocolo requer cérebros de camundongos que expressam proteínas fluorescentes em uma população esparsa ou mosaico de astrócitos. Fora este requisito, ratos de qualquer idade podem ser usados para este protocolo, com apenas pequenos ajustes nas configurações de perfusão e o vol…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A microscopia foi realizada no Núcleo de Microscopia de Neurociência da UNC (RRID:SCR_019060), apoiado em parte pelo financiamento do NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 e do NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. A Figura 1 foi criada com BioRender.com. As imagens e dados da Figura 4 são reimpressos de uma publicação anterior9 com permissão do editor.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
Referenzen
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