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Biologie

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

Published: September 09, 2022
doi:
10.3791/63866
, , , , , , , , , , ,
1Putuo People’s Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology,Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital,Fudan University

Summary

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

Abstract

다발성 경화증 (MS)은 염증성 침윤, 탈수초화 및 축삭 손상을 특징으로 하는 중추신경계(CNS)의 전형적인 자가면역 질환이다. 현재 MS를 완전히 치료할 수있는 조치는 없지만 질병 진행을 제어하고 완화하기 위해 여러 질병 수정 요법 (DMT)을 사용할 수 있습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)과 MS 환자의 CNS 병리학적 특징 사이에는 상당한 유사성이 있다. EAE는 MS 약물의 효능을 결정하고 MS 질환에 대한 새로운 치료법 개발을 모색하는 대표적인 모델로 널리 사용되었습니다. 마우스에서 EAE의 활성 유도는 안정하고 재현 가능한 효과를 가지며,자가 면역 신경 염증에 대한 약물 또는 유전자의 효과를 연구하는데 특히 적합하다. C57BL/6J 마우스를 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG35-55)로 면역화하는 방법과 임상 점수 시스템을 사용하여 질병 증상의 일일 평가가 주로 공유됩니다. 다양한 임상 증상을 가진 MS의 복잡한 병인을 감안할 때 기존 임상 점수 시스템은 질병 치료 평가를 만족시킬 수 없습니다. 단일 개입의 단점을 피하기 위해 MS 환자에서 불안과 유사한 기분 및 골다공증의 임상 증상을 기반으로 EAE를 평가하는 새로운 지표를 만들어 MS 치료에 대한보다 포괄적 인 평가를 제공합니다.

Introduction

자가면역질환은 자체 항원에 대한 면역계의 면역 반응으로 인해 조직 손상 또는 기능 장애를 초래하는 다양한 장애입니다1. 다발성 경화증 (MS)은 염증성 침윤, 탈수 초화 및 신경 축삭 변성 2,3을 특징으로하는 중추 신경계 (CNS)의 다발성 신경 병증의 만성자가 면역 질환입니다. 현재 MS는 전 세계적으로 250 만 명의 사람들에게 영향을 미쳤으며, 대부분 가족과 사회의 중추 인 20-40 세의 젊은 및 중년의 사람들입니다. 이것은 가족과 사회에 상당한 영향과 해를 끼쳤습니다 2,4.

MS는 다양하고 복잡한 임상 증상을 가진 다 인성 질환입니다. 염증성 침윤 및 탈수초화를 특징으로 하는 고전적인 신경 장애 외에도 MS는 종종 시각 장애, 사지 운동 이상증, 인지 및 정서 장애 5,6,7을 보여줍니다. MS 환자가 적절하고 올바른 치료를받지 못하면 절반은 20 년 후에 휠체어에서 살게되고 거의 절반이 우울 및 불안 증상을 경험하여 일반 인구보다 훨씬 높은 수준의 자살 충동을 느끼게됩니다 8,9.

오랜 연구 기간에도 불구하고 MS의 병인은 여전히 파악하기 어렵고 MS의 발병 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. MS의 동물 모델은 설치류와 인간 면역계의 중요한 차이에도 불구하고 질병 개발 및 새로운 치료법을 탐구하는 동시에 몇 가지 기본 원칙을 공유하는 테스트 도구 역할을 허용했습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 현재 MS 연구를 위한 이상적인 동물 모델로, 미엘린 단백질의 자가항원 면역을 사용하여 감수성 마우스에서 CNS 성분에 대한 자가면역을 유도하고 체액성 면역 반응을 향상시키기 위해 완전한 프로인트 보조제(CFA) 및 백일해 독소(PTX)를 추가합니다. 유전적 배경 및 면역 항원에 따라, MS10,11,12의 다양한 임상 형태를 모방하기 위해 급성, 재발-완화 또는 만성을 포함한 다양한 질병 과정이 얻어진다. EAE 모델의 구축에 일반적으로 사용되는 관련 면역원은 자가 CNS 단백질, 예컨대 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 또는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)으로부터 유래한다. MBP- 또는 PLP-면역화된 SJL/L 마우스는 재발-완화 과정을 개발하고, MOG는 C57BL/6 마우스11,12,13에서 만성 진행성 EAE를 유발한다.

질병 수정 요법 (DMT)의 주요 목적은 질병 증상을 최소화하고 기능을 개선하는 것입니다6. MS를 완화하기 위해 여러 약물이 임상적으로 사용되지만 아직 완전히 치료하는 데 사용되는 약물은 없으므로 시너지 치료의 필요성이 드러납니다. C57BL/6 마우스는 현재 트랜스제닉 마우스를 구축하는데 가장 통상적으로 사용되며, 이 작업에서, 5점 척도를 갖는 C57BL/6J 마우스에서 MOG35-55 에 의해 유도된 EAE 모델을 사용하여 질환 진행을 모니터링하였다. EAE 모델은 또한 불안-유사 기분 및 골 손실, 및 널리 공지된 탈수초성 병변을 앓고 있다. 여기서, 개방 필드 테스트 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro-CT) 분석을 사용하여 여러 관점에서 EAE의 증상을 평가하는 방법이 또한 설명된다.

Protocol

동지 대학의 동물 관리위원회는 현재의 작업을 승인했으며 모든 동물 관리 지침을 따랐습니다. 8-12주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 그룹에서 나이와 성별이 동일하다는 것이 보장되었습니다. 그렇지 않으면 질병에 대한 감수성이 영향을 받았습니다. 마우스는 일정한 조건 (실온 23 ± 1 ° C, 습도 50 % ± 10 %)에서 12 시간의 밝고 어두운 사이클을 번갈아 가며 마우스 음…

Representative Results

마우스의 면역화 후, 마우스의 체중을 매일 기록하고, 이들의 임상 증상을 상기 기재된 프로토콜에 따라 평가한다 (단계 4). MOG 펩타이드로 면역화 된 C57BL / 6J 마우스에서 병변의 위치는 주로 척수에 국한되어 있기 때문에 EAE 마우스의 병인은 꼬리 끝에서 머리로 퍼집니다. 질병의 시작 부분에서 EAE 마우스는 꼬리의 약점과 처짐을 나타내며 뒷다리의 약점, 조정되지 않은 움직임 및 마비가 뒤 따른?…

Discussion

MS는 CNS의 탈수초성 염증성 질환이며 젊은 사람들에게 만성 장애를 유발하는 가장 흔한 신경 질환 중 하나이며가족과 사회에 큰 부담을 줍니다3,4. MS는 항상 기관-특이적 T 세포-매개 자가면역 질환으로 분류되어, 자가면역계가 CNS를 천천히 침식하도록 유도하며, 이는 몸 전체에 걸쳐 다수의 시스템을 수반할 것이다27. 전형적인 임상 증…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 중국 국립 자연 과학 재단 (32070768, 31871404, 31900658, 32270754)과 국가 약물 연구 핵심 연구소의 지원을 인정합니다.

Materials

1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland
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Referenzen

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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).
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