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Biologie

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Published: September 09, 2022
doi:
10.3791/63866
, , , , , , , , , , ,
1Putuo People’s Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology,Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital,Fudan University

Summary

Il presente protocollo descrive l’induzione dell’encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all’encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l’analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una tipica malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e danno assonale. Attualmente, non ci sono misure per curare completamente la SM, ma sono disponibili più terapie modificanti la malattia (DMT) per controllare e mitigare la progressione della malattia. Esistono somiglianze significative tra le caratteristiche patologiche del SNC dell’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e dei pazienti con SM. L’EAE è stato ampiamente utilizzato come modello rappresentativo per determinare l’efficacia dei farmaci per la SM ed esplorare lo sviluppo di nuove terapie per la malattia della SM. L’induzione attiva di EAE nei topi ha un effetto stabile e riproducibile ed è particolarmente indicata per studiare gli effetti di farmaci o geni sulla neuroinfiammazione autoimmune. Il metodo di immunizzazione dei topi C57BL/6J con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) e la valutazione giornaliera dei sintomi della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico è principalmente condiviso. Data la complessa eziologia della SM con diverse manifestazioni cliniche, il sistema di punteggio clinico esistente non può soddisfare la valutazione del trattamento della malattia. Per evitare le carenze di un singolo intervento, vengono creati nuovi indicatori per valutare l’EAE sulla base delle manifestazioni cliniche di stati d’animo ansiosi e osteoporosi nei pazienti con SM per fornire una valutazione più completa del trattamento della SM.

Introduction

Le malattie autoimmuni sono uno spettro di disturbi causati dalla risposta immunitaria del sistema immunitario ai propri antigeni con conseguente danno o disfunzione tissutale1. La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica della polineuropatia nel sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e degenerazione assonale neuronale 2,3. Attualmente, la SM ha colpito ben 2,5 milioni di persone in tutto il mondo, per lo più giovani e persone di mezza età di età compresa tra 20 e 40 anni, che sono spesso la spina dorsale delle loro famiglie e della società. Ciò ha causato notevoli ripercussioni e danni alle famiglie e alla società 2,4.

La SM è una malattia multifattoriale con manifestazioni cliniche diverse e complesse. Oltre ai classici disturbi neurologici caratterizzati da infiltrazione infiammatoria e demielinizzazione, la SM mostra spesso deficit visivo, discinesia degli arti e disturbi cognitivi ed emotivi 5,6,7. Se i pazienti con SM non ricevono il trattamento adeguato e corretto, metà di loro vivrà in sedia a rotelle dopo 20 anni e quasi la metà di loro sperimenterà sintomi depressivi e ansiosi, portando a livelli molto più elevati di ideazione suicidaria rispetto alla popolazione generale 8,9.

Nonostante un lungo periodo di ricerca, l’eziologia della SM rimane elusiva e la patogenesi della SM non è stata ancora chiarita. I modelli animali di SM hanno permesso di servire come strumenti di test per esplorare lo sviluppo della malattia e nuovi approcci terapeutici, nonostante le differenze significative tra il sistema immunitario dei roditori e quello umano, condividendo allo stesso tempo alcuni principi di base. L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è attualmente il modello animale ideale per lo studio della SM, che utilizza l’immunità autoantigenica dalle proteine della mielina per indurre l’autoimmunità ai componenti del SNC nei topi sensibili, con l’aggiunta di adiuvante completo di Freund (CFA) e tossina della pertosse (PTX) per migliorare la risposta immunitaria umorale. A seconda del background genetico e degli antigeni immunitari, si ottengono diversi processi patologici, tra cui acuto, recidivante-remittente o cronico, per imitare varie forme cliniche di SM10,11,12. Gli immunogeni rilevanti comunemente usati nella costruzione di modelli EAE provengono da proteine del SNC, come la proteina basica della mielina (MBP), la proteina proteolipidica (PLP) o la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG). I topi SJL/L immunizzati con MBP o PLP sviluppano un decorso recidivante-remittente e la MOG innesca EAE cronica progressiva nei topi C57BL/611,12,13.

Lo scopo principale della terapia modificante la malattia (DMT) è ridurre al minimo i sintomi della malattia e migliorare la funzione6. Diversi farmaci sono usati clinicamente per alleviare la SM, ma nessun farmaco è stato ancora usato per curarla completamente, rivelando la necessità di un trattamento sinergico. I topi C57BL / 6 sono attualmente i più comunemente usati per costruire topi transgenici e, in questo lavoro, è stato utilizzato un modello EAE indotto da MOG35-55 in topi C57BL / 6J con una scala a 5 punti per monitorare la progressione della malattia. I modelli EAE soffrono anche di stati d’animo ansiosi e perdita ossea e lesioni demielinizzanti ampiamente note. Qui viene descritto anche il metodo per valutare i sintomi dell’EAE da più prospettive utilizzando test in campo aperto e analisi di tomografia micro-computerizzata (Micro-CT).

Protocol

Il Comitato per la cura degli animali dell’Università di Tongji ha approvato il presente lavoro e sono state seguite tutte le linee guida per la cura degli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J tra 8-12 settimane di età. È stato assicurato che l’età e il sesso fossero gli stessi nei gruppi sperimentali; Altrimenti, la suscettibilità alla malattia è stata influenzata. I topi sono stati alloggiati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni con cicli alternati di lu…

Representative Results

Dopo l’immunizzazione dei topi, il peso corporeo dei topi viene registrato quotidianamente e i loro sintomi clinici vengono valutati secondo il protocollo sopra descritto (fase 4). Nei topi C57BL/6J immunizzati con peptide MOG, poiché la posizione della lesione è principalmente limitata al midollo spinale, la patogenesi dei topi EAE si diffonde dalla coda alla testa. All’inizio della malattia, i topi EAE mostrano debolezza e abbassamento della coda, seguiti da debolezza degli arti posteriori, movimento scoordinato e pa…

Discussion

La SM è una malattia infiammatoria demielinizzante del SNC ed è uno dei disturbi neurologici più comuni che causano disabilità cronica nei giovani, imponendo un enorme onere alle famiglie e alla società 3,4. La SM è sempre stata classificata come una malattia autoimmune mediata dalle cellule T organo-specifiche, inducendo il sistema autoimmune a erodere lentamente il SNC, che coinvolgerà più sistemi in tutto il corpo27. I sintomi c…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il sostegno della National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) e dello State Key Laboratory of Drug Research.

Materials

1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland
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Referenzen

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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).
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