Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial
Summary
O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.
Abstract
A junção neuromuscular (NMJ) é uma estrutura complexa que serve para a comunicação do sinal do neurônio motor ao músculo esquelético e consiste em três componentes histológicos essenciais: os terminais de axônio motor pré-sináptico, receptores de acetrico nicotípico pós-sináptico (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs). Para demonstrar as características morfológicas do NMJ, o músculo gastrocnemius medial de ratos foi selecionado como o tecido-alvo e examinado pelo uso de múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores, incluindo neurofilamento 200 (NF200) e transporte de acetilcolina vesicular (VAChT) para as fibras nervosas motoras e seus terminais pré-sinápticos, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para os AchRs nicotípicos pós-sinápticos, e S100 para os PSCs. Neste estudo, a coloração foi realizada em dois grupos: no primeiro grupo, as amostras foram manchadas com NF200, VAChT e α-BTX, e no segundo grupo, as amostras foram manchadas com NF200, α-BTX e S100. Foi demonstrado que ambos os protocolos podem demonstrar efetivamente a estrutura detalhada do NMJ. Utilizando o microscópio confocal, características morfológicas dos terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e PSC foram vistos, e suas imagens de pilhas Z foram reconstruídas em um padrão tridimensional para analisar melhor a correlação espacial entre as diferentes rotulagens. Na perspectiva da metodologia, esses protocolos fornecem uma referência valiosa para a investigação das características morfológicas do NMJ em condições fisiológicas, que também podem ser adequadas para avaliar a alteração patológica do NMJ, como lesão nervosa periférica e regeneração.
Introduction
Como três componentes estruturais essenciais da junção neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, aspectos morfológicos dos terminais de axônio motor pré-sináptico, membrana pós-sináptica contendo receptores de acetilcolina nicotínica (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs) têm sido amplamente investigadas. Seções finas e espécimes de montagem inteira dos músculos esqueléticos foram examinados com diferentes técnicas histológicas, como microscopia eletrônica 5,6, microscopia confocal 7,8 e microscopia de folha de luz 9,10. Embora as características morfológicas do NMJ tenham sido demonstradas por essas técnicas de diferentes aspectos, como comparação, a microscopia confocal ainda é uma escolha ideal para a imagem da morfologia detalhada do NMJ.
Recentemente, muitas novas tecnologias foram desenvolvidas para mostrar os componentes estruturais do NMJ. Por exemplo, camundongos fluorescentes transgênicos thy1-YFP têm sido diretamente usados para observar axônios motores e placas finais motoras in vivo e in vitro 10,11. Além disso, a injeção intravenosa de α-BTX fluorescente foi aplicada para revelar a distribuição espacial de placas finais motoras em músculos esqueléticos de tipo selvagem e fluorescentes transgênicos, utilizando tratamento de limpeza óptica de tecido para exame com microscopia de folha de luz 9,12. No entanto, além dos elementos pré e pós-sinápticos que podem ser vistos por esses métodos avançados, os PSCs não podem ser demonstrados ao mesmo tempo.
O acúmulo de evidências indica que os PSCs, como as células gliais periféricas, estão intimamente associados aos terminais pré-sinápticos que contribuem para o desenvolvimento e estabilidade do NMJ, a modulação da atividade sináptica do NMJ sob a condição fisiológica e a regeneração do NMJ após lesão nervosa 13,14,15 . Considerando a arquitetura celular do NMJ, este protocolo é um candidato adequado para rotular simultaneamente os PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, e é potencialmente usado para avaliar a integridade e plasticidade do NMJ em condições normais e patológicas. Por exemplo, compare a intensidade do NMJ, morfologia e volume de placas finais motoras pós-sinápticas, inervação e denervação do NMJ, e número de PSCs em músculos de estado fisiológico e patológico.
O músculo gastrocnemius é o maior músculo formando a protuberância na panturrilha, que é facilmente dissecada pela remoção da pele e do músculo bíceps femoral do membro. O músculo é frequentemente escolhido para avaliar atrofia muscular, degeneração neuromuscular, desempenho muscular e força da unidade motora ex vivo ou in vivo 16,17,18. No entanto, a técnica também é adequada para revelar as características morfológicas do NMJ de vários músculos esqueléticos. Ao mesmo tempo, as seções musculares grossas podem revelar morfologia mais completa e quantidade de NMJ em comparação com as seções finas 7,8 e as fibras muscularesprovocadas 19.
De acordo com esses estudos, o músculo gastrocnemius medial de rato foi selecionado como o tecido-alvo neste estudo e foi fatiado com uma espessura de 80 μm para múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores de acordo com os componentes estruturais do NMJ. Aqui, neurofilamento 200 (NF200)20,21, transporte de acetilcolina vesicular (VAChT)22, alfa-bungarotoxina (α-BTX)23,24 e S10025,26 foram usados para rotular fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, AchRs pós-sinápticos e PSCs, respectivamente. Além disso, o fundo do tecido muscular e núcleos celulares foram ainda mais neutralizados com fálica e DAPI.
Neste estudo, esperamos desenvolver um protocolo refinado para coloração simultânea da arquitetura celular do NMJ com seus biomarcadores correspondentes em espécimes fixos mais espessos, o que é mais conveniente para uso em microscopia confocal e ajuda a obter muito mais informações sobre a estrutura detalhada dos PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, bem como sua correlação espacial entre si. Na perspectiva da metodologia, esse protocolo pode beneficiar-se da avaliação das características morfológicas do NMJ em condições normais e patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos os detalhes técnicos necessários para a realização de uma coloração múltipla bem sucedida de fatias musculares e o uso de imunohistoquímica fluorescente para revelar as características morfológicas do NMJ nas seções grossas do músculo gastrocnemius medial de ratos. Usando esta abordagem, os detalhes finos e correlação espacial dos PSCs e elementos pré e pós-sinápticos podem ser analisados e apreciados sob microscopia confocal, e reconstruídos em um padrão tridimensional. Aqui, vários tipo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelo CacmS Innovation Fund (Nº. CI2021A03407), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82004299) e fundos fundamentais de pesquisa para os Institutos Centrais de Pesquisa em Bem-Estar Público (Nº. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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