FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln
Summary
Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.
Abstract
Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von skelettmuskelresidenten mesenchymalen Stromazellen (MSCs), die sich entlang fibrogener, adipogener, osteogener oder chondrogener Linie differenzieren können. Zusammen mit Muskelstammzellen (MuSCs) spielen FAPs eine entscheidende Rolle bei der Muskelhomöostase, -reparatur und -regeneration, während sie die extrazelluläre Matrix (ECM) aktiv erhalten und umgestalten. Bei pathologischen Zuständen wie chronischen Schäden und Muskeldystrophien werden FAPs anomal aktiviert und differenzieren sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten, was zu Fibrose und intramuskulärer Fettinfiltration führt. Daher spielen FAPs eine doppelte Rolle bei der Muskelregeneration, indem sie entweder den MuSC-Umsatz aufrechterhalten und die Gewebereparatur fördern oder zur fibrotischen Narbenbildung und ektopischen Fettinfiltraten beitragen, die die Integrität und Funktion des Skelettmuskelgewebes beeinträchtigen. Eine ordnungsgemäße Reinigung von FAPs und MuSCs ist eine Voraussetzung für das Verständnis der biologischen Rolle dieser Zellen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen. Hier beschreiben wir eine standardisierte Methode zur gleichzeitigen Isolierung von FAPs und MuSCs aus der Extremitätenmuskulatur erwachsener Mäuse mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Das Protokoll beschreibt detailliert die mechanische und enzymatische Dissoziation von einkernigen Zellen aus ganzen Extremitätenmuskeln und verletzten Tibialis anterior (TA) Muskeln. FAPs und MuSCs werden anschließend mit einem halbautomatischen Zellsortierer isoliert, um reine Zellpopulationen zu erhalten. Darüber hinaus beschreiben wir eine optimierte Methode zur Kultivierung ruhender und aktivierter FAPs und MuSCs, entweder allein oder unter Kokulturbedingungen.
Introduction
Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe im Körper, macht ~ 40% des erwachsenen menschlichen Gewichts aus und ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Körperhaltung, die Erzeugung von Bewegung, die Regulierung des Grundenergiestoffwechsels und der Körpertemperatur1. Die Skelettmuskulatur ist ein hochdynamisches Gewebe und besitzt eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich an eine Vielzahl von Reizen wie mechanische Belastungen, metabolische Veränderungen und tägliche Umweltfaktoren anzupassen. Darüber hinaus regeneriert sich die Skelettmuskulatur als Reaktion auf akute Verletzungen, was zu einer vollständigen Wiederherstellung ihrer Morphologie und Funktionen führt2. Die Plastizität der Skelettmuskulatur beruht hauptsächlich auf einer Population residenter Muskelstammzellen (MuSCs), auch Satellitenzellen genannt, die sich zwischen der Myofaser-Plasmamembran und der Basallamina 2,3 befinden. Unter normalen Bedingungen befinden sich MuSCs in der Muskelnische in einem Ruhezustand, mit nur wenigen Teilungen, um den Zellumsatz zu kompensieren und den Stammzellpool wieder aufzufüllen4. Als Reaktion auf Verletzungen treten MuSCs in den Zellzyklus ein, vermehren sich und tragen entweder zur Bildung neuer Muskelfasern bei oder kehren in einem Selbsterneuerungsprozess in die Nische zurück 2,3. Zusätzlich zu MuSCs hängt die homöostatische Aufrechterhaltung und Regeneration der Skelettmuskulatur von der Unterstützung einer Population muskelresidenter Zellen ab, die als fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) bezeichnet werden5,6,7. FAPs sind mesenchymale Stromazellen, die in das Muskelbindegewebe eingebettet sind und in der Lage sind, sich entlang der fibrogenen, adipogenen, osteogenen oder chondrogenen Linie 5,8,9,10 zu differenzieren. FAPs bieten strukturelle Unterstützung für MuSCs, da sie eine Quelle für extrazelluläre Matrixproteine in der Muskelstammzellnische sind. FAPs fördern auch die langfristige Erhaltung der Skelettmuskulatur, indem sie Zytokine und Wachstumsfaktoren sezernieren, die trophische Unterstützung für Myogenese und Muskelwachstum bieten 6,11. Bei akuten Muskelverletzungen vermehren sich FAPs schnell, um eine vorübergehende Nische zu erzeugen, die die strukturelle Integrität des regenerierenden Muskels unterstützt und eine günstige Umgebung bietet, um die Proliferation und Differenzierung von MuSCs auf parakrine Weise aufrechtzuerhalten5. Mit fortschreitender Regeneration werden FAPs durch Apoptose aus dem regenerativen Muskel entfernt und ihre Anzahl kehrt allmählich auf das Basalniveau12 zurück. Unter Bedingungen, die chronische Muskelverletzungen begünstigen, überschreiben FAPs jedoch die pro-apoptotische Signalisierung und sammeln sich in der Muskelnische an, wo sie sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten differenzieren, was zu ektopischen Fettinfiltraten und fibrotischer Narbenbildung führt12,13.
Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer regenerativen Fähigkeiten wurden FAPs und MuSCs als potenzielle Ziele in der regenerativen Medizin zur Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen identifiziert. Um ihre Funktion und ihr therapeutisches Potenzial zu untersuchen, ist es daher wichtig, effiziente und reproduzierbare Protokolle für die Isolierung und Kultur von FAPs und MuSCs zu erstellen.
Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kann verschiedene Zellpopulationen anhand morphologischer Merkmale wie Größe und Granularität identifizieren und ermöglicht eine zellspezifische Isolierung basierend auf der Verwendung von Antikörpern, die gegen Zelloberflächenmarker gerichtet sind. Bei erwachsenen Mäusen exprimieren MuSCs das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1, auch bekannt als CD106)14,15 und α7-Integrin15, während FAPs den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptor α (PDGFRα) und das Stammzellantigen 1 (Sca1 oder Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 exprimieren. . In dem hier beschriebenen Protokoll wurden MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ identifiziert, während FAPs als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- identifiziert wurden. Alternativ wurden PDGFRαEGFP-Mäuse verwendet, um FAPs als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- Ereignisse18,19 zu isolieren. Darüber hinaus verglichen wir die Überlappung zwischen dem Fluoreszenzsignal von PDGFRα-GFP+-Zellen mit Zellen, die durch den Oberflächenmarker Sca1 identifiziert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass alle GFP-exprimierenden Zellen auch positiv für Sca1 waren, was darauf hindeutet, dass beide Ansätze für die Identifizierung und Isolierung von FAPs verwendet werden können. Schließlich bestätigte die Färbung mit spezifischen Markerantikörpern die Reinheit jeder Zellpopulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Etablierung effizienter und reproduzierbarer Protokolle für die Identifizierung und Isolierung von reinen adulten Stammzellpopulationen ist der erste und kritischste Schritt zum Verständnis ihrer Funktion. Isolierte FAPs und MuSCs können zur Durchführung von Multiomics-Analysen in Transplantationsexperimenten als potenzielle Behandlung von Muskelerkrankungen verwendet oder für die Krankheitsmodellierung in der Stammzelltherapie genetisch modifiziert werden.
Das hier beschriebene Prot…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) für die Beratung zur MuSC-Isolation. Diese Arbeit wurde vom NIAMS-IRP durch die NIH-Zuschüsse AR041126 und AR041164 finanziert.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referenzen
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