Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.
Zirkulierende und geweberesidente extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen vielversprechende Ziele als neuartige theranostische Biomarker dar und erweisen sich als wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der organismischen Homöostase und dem Fortschreiten eines breiten Spektrums von Krankheiten. Während sich die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung endogener Exosomen mit endosomalem Ursprung konzentriert, haben Mikrovesikel, die aus der Plasmamembran blähen, zunehmend an Aufmerksamkeit in den Bereichen Gesundheit und Krankheit gewonnen, die sich durch eine Fülle von Oberflächenmolekülen auszeichnen, die die Membransignatur von Elternzellen rekapitulieren. In dieser Arbeit wird ein reproduzierbares Verfahren vorgestellt, das auf der Differentialzentrifugation basiert, um EVs aus dem Plasma und festen Geweben, wie z.B. dem Knochen, zu extrahieren und zu charakterisieren. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die anschließende Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die somit auf ihre Ableitungen zurückgeführt und mit Komponenten identifiziert werden können, die mit einer potenziellen Funktion in Verbindung stehen. Diese Methode wird für die korrelative, funktionelle und mechanistische Analyse von EVs in biologischen, physiologischen und pathologischen Studien nützlich sein.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden vorgeschlagen, um zellfreigesetzte Lipiddoppelschicht-eingeschlossene extrazelluläre Strukturenzu definieren 1, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Ereignissenspielen 2. EVs, die von gesunden Zellen freigesetzt werden, können grob in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, nämlich Exosomen (oder kleine EVs), die durch einen intrazellulären endozytären Transportweg3 gebildet werden, und Mikrovesikel (oder große EVs), die durch die nach außen gerichtete Knospung der Plasmamembran der Zelle4 entstehen. Während sich viele Studien auf die Funktion von EVs konzentrieren, die aus kultivierten Zellen in vitro5 gewonnen wurden, sind EVs, die aus dem Kreislauf oder Gewebe stammen, komplexer und heterogener, was den Vorteil hat, dass sie den wahren Zustand des Organismus in vivo widerspiegeln 6. Darüber hinaus können fast alle Arten von Geweben EVs in vivo produzieren, und diese EVs können als Botenstoffe innerhalb des Gewebes fungieren oder von verschiedenen Körperflüssigkeiten, insbesondere dem peripheren Blut, übertragen werden, um die systemische Kommunikation zu erleichtern7. EVs im Kreislauf und im Gewebe sind auch Ziele für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten8.
Während Exosomen in den letzten Jahren intensiv erforscht wurden, haben Mikrovesikel auch wichtige biologische Funktionen, die ohne Ultrazentrifugation leicht extrahiert werden können und so die Grundlagen- und klinische Forschung fördern9. Ein kritisches Problem in Bezug auf EVs, die aus dem Kreislauf und dem Gewebe isoliert wurden, besteht darin, dass sie von verschiedenen Zelltypen stammen10. Da Mikrovesikel von der Plasmamembran abgeblasen werden und durch eine Fülle von Zelloberflächenmolekülen9 gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von Markern für die Mutterzellmembran zur Identifizierung des zellulären Ursprungs dieser EVs möglich. Insbesondere kann die Technik der Durchflusszytometrie (FC) zum Nachweis von Membranmarkern eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Forscher die Elektrofahrzeuge isolieren und weitere Analysen auf der Grundlage der funktionalen Ladungen durchführen.
Das vorliegende Protokoll bietet ein gründliches Verfahren zur Extraktion und Charakterisierung von EVs aus in vivo Proben. Die EVs werden mittels Differentialzentrifugation isoliert, und die Charakterisierung der EVs umfasst die morphologische Identifizierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Herkunftsanalyse mittels FC und Proteinfrachtanalyse mittels Western Blot. Das Blutplasma und der Oberkieferknochen von Mäusen werden als Repräsentanten verwendet. Forscher können auf dieses Protokoll für Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zurückgreifen und entsprechende Änderungen vornehmen.
Bei der Untersuchung der Merkmale, des Verbleibs und der Funktion von Elektrofahrzeugen ist es von entscheidender Bedeutung, Elektrofahrzeuge mit hoher Ausbeute und geringer Kontamination zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von EVs, wie z. B. Dichtegradientenzentrifugation (DGC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und Immunocapture-Assays 4,20. Hier kam eine der am häufigsten verwendeten Methoden, die Differentialzentrifugation, zum E…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 und 81930025) und der China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 und BX20190380) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung des National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |