מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

Summary

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

Abstract

קו עכברים תעתיק הפוך של טלומראז (Tert) פותח כדי לחקור את ההתנהגות והגורל של תאי גזע של רקמות בוגרות, על ידי חציית מערכת ‘Tet-On’ oTet-Cre עכבר oTet-Cre עם טרנסגן טרנסאקטיבטור טטרציקלין הפוך (rtTA) חדשני המקושר למקדם Tert, שהדגמנו מסמן אוכלוסייה חדשה של תאי גזע במוח בוגרים. כאן, מתן נגזרת הטטרציקלין דוקסיציקלין ל-mTert-rtTA::oTet-Cre עכברים יסמן באופן בלתי נמנע אוכלוסייה של תאים המבטאים שבר של 4.4 קילו-בייט של האזור המקדם של הגן טרט. כאשר משלבים את כתב Rosa-mTmG, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG עכברים יבטאו את הממברנה tdTomato (mTomato) עד שהטיפול בדוקסיציקלין יגרום להחלפת ביטוי mTomato בממברנה EGFP (mGFP) בתאים שגם מבטאים את טרט. לכן, כאשר עכברי מעקב אחר שושלת משולשת-מהונדסת אלה מקבלים דוקסיציקלין (תקופת ה”דופק” שבמהלכה מסומנים תאים המבטאים TERT), תאים אלה יהפכו לתאי mGFP+ המסומנים באופן בלתי נדלה, שניתן לעקוב אחריהם במשך כל פרק זמן רצוי לאחר הסרת דוקסיציקלין (תקופת ה”מרדף”), גם אם ביטוי Tert יאבד לאחר מכן. לאחר מכן מוחות מקובעים על-ידי פרפוזיה ומעובדים עבור אימונופלואורסצנציה ויישומים אחרים במורד הזרם, על מנת לפרש שינויים בהפעלת תאי גזע, התפשטות, מחויבות לשושלת, הגירה לנישות מוחיות שונות והתמיינות לסוגי תאים בוגרים. באמצעות מערכת זו, כל עכבר rtTA יכול להזדווג עם oTet-Cre וכתב רוזה כדי לערוך ניסויי שושלת “מרדף דופק” של דוקסיציקלין באמצעות סמנים של תאי גזע.

Introduction

הערך של שושלת מעקב אחר קו עכבר
ניתוח של תאי גזע in vivo יכול להיות קשה מכיוון שמבחנים רבים הבוחנים תאים כאלה מתמקדים רק באפיון תאים אלה בזמן המוות של החיה, המייצג תמונת מצב סופנית בזמן. כדי להבין טוב יותר את תהליכי ההתרבות, ההתמיינות והנדידה של תאי אב, סוגי תאי ביניים/מעבר ותאים בוגרים לאורך זמן, נדרשת גישת ניתוח אורכי. ניתן להשיג זאת באמצעות מחקרי מעקב אחר שושלת לפיהם תאי גזע/אב מסומנים באופן בלתי ניתן לערעור וניתן לעקוב אחריהם במשך כל פרק זמן לאחר^{מכן 1}.

במוח היונקים הבוגרים, תהליך הנוירוגנזה שבו נוירונים שנולדו בוגרים נוצרים מתאי גזע ותאי אב נותח לראשונה באמצעות שימור תוויות עם תימידין-H^{3 2,3,4} או 5-ברומו-2′-דאוקסיורידין (BrdU)^5,6,7,8 . במחקרים אלה, תאים מתרבים סומנו באנלוגית התימין, אשר שולבה בדנ”א של התאים במהלך שכפול וחלוקת תאים/התפשטות. התא המסומן, כמו גם צאצאיהם, הכילו אפוא את האנלוגיה הזו, שזוהתה לאחר המוות. עם זאת, בעוד שתימידין-H³ ו-BrdU אפשרו סימון של תאים מתרבים וצאצאיהם באזורים במוח שבהם תאי גזע לא הובנו כראוי, מחקרים אלה הופרעו על ידי החסרונות של כלים אלה. Thymidine-H³ גורם למעצר מחזור תאים, אפופטוזיס ועיכוב סינתזת DNA תלוי מינון⁹, בעוד BrdU מסמן תאים ברמות משתנות בהתאם לנתיב מתן¹⁰ ונקלט על ידי תאים במהלך תיקון או אפופטוזיס, כמו גם במהלך חלוקת תאים¹¹. שיטות תיוג יעילות יותר שימשו לאחרונה, כגון תיוג עם 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), אך רבות מאותן בעיות כמו BrdU עדיין נותרו¹². גישות אלה מגבילות גם בכך שהן מסמנות כל תא שגשוג, לא רק תאי גזע, ולכן פרשנות התוצאות עלולה להיות מבלבלת. בשושלת הנוירוגנית, כל תאי הגזע והאב הקדמון שומרים על יכולת מיטוטית, ורק תאי עצב סופניים/בוגרים אינם מתרבים. עבור אסטרוציטים ומיקרוגליה, אך לא אוליגודנדרוציטים, התפשטות נשמרת ללא הגבלת זמן 13,14,15.

עכברים מהונדסים המשמשים לשושלת עקבות רק אחר תאים שמביעים חלבון בעל עניין, כמו זה שאושר לזיהוי תאי גזע בוגרים כפי שאנו משתמשים כאן, הפכו לפיכך לנפוצים יותר כאשר חוקרים תאי גזע וצאצאיהם. למרות שקשה ליצור באמצעות גישות מהונדסות של עכברים, קווי עכברים המתחקים אחר שושלות מאפשרים מעקב אחר תאים מסומנים במיוחד במוח, ואינם מסתמכים על התפשטות בלבד. במערכת העכברים המהונדסים Tet-On, מתן טטרציקלין או דוקסיציקלין (נגזרת טטרציקלין) גורם לביטוי Cre-recombinase בתאים שהונדסו עם טרנסאקטיבטור טטרציקלין הפוך (rtTA), אשר מתועתק על ידי מקדם עניין. לאחר מכן, הרקומבינציה המונעת על-ידי ה-Cre, שאינה ניתנת למחיקה, תפעיל את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי או זוהר בלתי ניתן למחיקה בתאים המעניינים, בהתאם לעכבר רוזה-עיתונאי שהופעל. תאים אלה, המסומנים באופן בלתי נמנע, ממשיכים לבטא את הכתב הזה לאחר חלוקה, התמיינות או נדידה, ומאפשרים מעקב אחר תאים אלה וצאצאיהם לאורך זמן או לאחר התערבויות שונות¹⁶. היתרונות של גישות התחקות אחר שושלת מהונדסות כוללים: 1) ספציפיות של התחקות אחר שושלת תאים מסוימת או אב/תא גזע המסומן על ידי rtTA, 2) ביטוי בל יימחה של החלבון הפלואורסצנטי או הזוהר למרות תחלופת התאים או התמיינותם, 3) רעילות נמוכה, 4) הפעלה מותנית בכל נקודה במחזור החיים של החיה, ו-5) קלות השימוש במבחנים נפוצים, כולל חיסון/אימונופלואורסצנציה¹⁶.

שיטות אחרות של כלי כתבים בלתי ניתנים להשראה בעכברים כוללות שימוש בעכברי Cre-ERT2, אשר ניתן להצמידם עם ROSA-GFP, ROSA-mTmG, או טרנסגנים אחרים של כתבים פלואורסצנטיים. בחיות אלה, אלמנט רגולטורי ספציפי לתא, כגון מקדם או אזור משפר עניין, מניע את הייצור של Cre recombinase, אשר יכול להיות מופעל רק באמצעות מתן טמוקסיפן. בעוד שקווי עכבר Cre-ERT2 מאפשרים השראה של Cre בקווי תאים ספציפיים, יש שפע של ידע המפרט את ההשפעות של טמוקסיפן על נוירוגנזה בוגרת^17,18. בנוסף, קיימים גנים רבים של כתבים פלואורסצנטיים המונעים על ידי ROSA שניתן להשתמש בהם במקום GFP או mTmG, כולל YFP או CFP, אשר יאפשרו תיוג פלואורסצנטי חלופי באורכי גל פלואורסצנטיים אחרים. ניתן להשתמש בגנים אלה של דיווח פלואורסצנטי עם מערכות Tet-On או Cre-ERT2.

טרנסקריפטאז הפוך של טלומראז (TERT) הוא הרכיב המגביל את הקצב של ההולואנזים טלומראז, הפועל להרחבת הטלומרים לאחר קיצורם במהלך חלוקת התא^19,20. TERT זוהה כסמן של תאי גזע של רקמה בוגרת במעי^21,22, מח עצם²¹, כבד²³, שומן²⁴, רירית הרחם^25,26 ועצם¹. עדיין לא ידוע אם ביטוי TERT בתאי גזע בוגרים אלה נועד אך ורק לפעילות המרחיבה טלומראז או לביצוע תפקידי TERT שאינם קנוניים²⁷. תאי גזע בוגרים (qASCs) המבטאים TERT זוהו ונמצאו במעקב ברחבי הגוף עם עכברי מעקב אחר שושלת מהונדסת כדי לחקור את יכולת הרב-פוטנטיות וההתחדשות העצמית של תאי גזע אלה, כמו גם את הפוטנציאל שלהם להפעיל, להתרבות, להתמיין ולהגר 1,22,23,28. יצירת הטרנסג’ן Tert-rtTA בוצעה בעבר¹. במאמר זה נתאר את השימוש בקו עכברי TERT למעקב אחר שושלת כדי לחקור TERT + qASCs שזיהינו כאוכלוסיית ASC חדשנית במוח העכבר הבוגר.

יצירת שושלת מהונדסת העוקבת אחר קו עכברים
כדי ליצור קו עכברים המתחקה אחר שושלת באמצעות מערכת Tet-On, יש לשלב שלושה טרנסג’נדרים בתוך חיה אחת באמצעות הזדווגות עכברים. הראשון הוא rtTA, המתבטא בשליטתו של מקדם הגן המעניין (שלנו הוא TERT-rtTA). בתא שמבטא את הגן המעניין הזה, ה-rtTA יבוא לידי ביטוי. השני הוא גן oTet-Cre, המכיל אלמנט תגובת טטרציקלין (TRE) שיאפשר שעתוק של Cre רקומבינאז בנוכחות תעתיק היתוך rtTA וטטרציקלין או דוקסיציקלין. טטרציקלין או דוקסיציקלין יכולים להינתן לבעל חיים באמצעות מי שתייה או צ’או²⁹. לבסוף, חייב להיות גן שיופעל על ידי מחשוף קר רקומבינאז. בכתב יד זה, גן התיוג שנתאר הוא הגן Rosa26-mTmG, אשר עד רקומבינציה של Cre תתמלל בכל מקום mTomato (פלואורסצנציה אדומה של קרום בכל התאים). עם זאת, אם תא מבטא את תעתיק ה-rtTA ומכיל טטרציקלין או דוקסיציקלין, רקומבינציה של Cre של קבוצה של אתרי lox P בין אתרי mTomato ו-mGFP תשנה את אתר R26 ותגרום לתא לייצר ממברנה EGFP (mGFP, או פלואורסצנציה ירוקה של ממברנה) במקום עגבניית ממברנה. האופי הבלתי ניתן למחיקה של אות mGFP זה יאפשר תיוג ומעקב in vivo של תאים בזמן שהם מתרבים, נודדים ומתמיינים. בעקבות העקבות, ניתן לנתח תאים לביטוי של GFP באמצעות אימונופלואורסצנציה בקריוזקציות סטנדרטיות או במוחות עבים יותר המנוקים אופטית.

במאמר זה נתאר את השימוש בקו העכבר הספציפי, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. כדי ליצור את קו העכברים המהונדס המשולש הזה, הזדווגנו תחילה עם חיות oTet-Cre (זן מעבדת ג’קסון #006234) עם חיות רוזה-mTmG (זן מעבדת ג’קסון #007676) כדי ליצור oTet-Cre::Rosa-mTmG עכברים מהונדסים כפולים. בעלי חיים אלה עברו גנוטיפ עם פריימרים ותבניות PCR שצוינו בטבלאות משלימות 1 ו-2. עכברי mTert-rtTA (שנוצרו על ידי דייוויד בריו¹) הזדווגו לבעלי חיים oTet-Cre::Rosa-mTmG כדי ליצור mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG עכברים (איור 1A)^1,30. מנגנון הפעולה של קו העכבר mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG מתואר באיור 1B.

אינדוקציה של דוקסיציקלין ועיצוב מרדף דופק
בעת תכנון ניסויים, חשוב לקחת בחשבון מספר גורמים שישפיעו על תוצאות ניסויי מעקב אחר שושלת, כולל גיל החיה באינדוקציה של דוקסיציקלין, משך מתן דוקסיציקלין (תקופת “הדופק”), משך הזמן לאחר הסרת דוקסיציקלין לפני איסוף הרקמות (תקופת “המרדף”), ותזמון ההתערבויות במהלך תהליכים אלה. שיקולי תכנון מחקר אלה חיוניים להבנת התאים המסומנים וצאצאיהם בסיום הניסוי. השלב הראשון בתהליך הוא לזהות את גיל העניין של החיה ואת משך מתן הדוקסיציקלין. תקופות פולס ארוכות יותר יאפשרו לפוטנציאל של תאים נוספים לבטא את המקדם המקושר ל-rtTA כדי לבוא לידי ביטוי ולכך שיותר תאים בעלי עניין יסומנו באופן בלתי נמנע. סוג תא המציג ביטוי חולף של הגן המעניין עשוי לדרוש תקופת דופק ארוכה יותר מאשר תאים המבטאים באופן רציף את הגן המעניין. עם זאת, אם מטרת המחקר היא להבין את ההשפעות קצרות הטווח של התא המעניין או התערבות חריפה, תקופת הדופק לא יכולה להיות ארוכה מדי, שכן ברגע שתא מסומן, הוא יעבור דרך כל מספר של שינויים במהלך שארית תקופת הדופק. בחלק מהמחקרים שלנו, דופק של יומיים ללא תקופת מרדף שימש כדי לחקות באופן הדוק יותר כתב ישיר עבור TERT. הסיבה לכך היא שמשך הזמן המינימלי לרקומבינציה של הגן Rosa-mTmG הוא יומיים³¹.

התקופה החיונית הבאה בניסוי מרדף דופק היא האורך שבין הסרת דוקסיציקלין לזלוף של החיה, הידוע גם בשם ‘המרדף’. זמן מחצית החיים של דוקסיציקלין בעכברים הוא כ-170 דקות ללא קשר למסלול ההנחיה, מה שמאפשר את המסקנה כי אינדוקציה של דוקסיציקלין ככל הנראה כבר לא מתרחשת מספר שעות לאחר ההסרה³². עם זאת, חשוב לציין כי חילוף החומרים של דוקסיציקלין איטי יותר בעכברים מזדקנים, מה שעלול להוביל לתקופות ‘דופק’ יעילות יותר מאשר בעלי חיים צעירים^{בני 33}.

במהלך תקופת המרדף, תאים מסומנים ימשיכו להיות מסומנים, גם לאחר התפשטות, התמיינות או נדידה. גם הצאצאים של תאים אלה יסומנו. מטרת המחקר תעצב את אורך פרדיגמת מרדף הדופק. אם מטרת המחקר היא להבין את ההתחדשות של רקמה לאורך תקופה ארוכה של זמן עם התאים המעניינים, ייתכן שתידרש תקופת מרדף ארוכה. לבסוף, יש להחליט על עיתוי ההתערבויות או הטיפולים. מתן במהלך תקופת הדופק ישפיע על התאים המבטאים את גן העניין כמו גם על כל צאצא שנוצר במהלך תקופה זו, בעוד שהמתן במהלך תקופת המרדף עשוי להשפיע בעיקר על צאצאי התאים המעניינים, אם כי הדבר יהיה תלוי במהירות שבה התאים המסומנים מתחלקים או מתמיינים. דוגמאות לתכנון ניסיוני של מרדף דופק שהשתמשנו בו מתוארות באיור 2A.

חשוב גם להיות מודעים לאפשרות של אות GFP ברקע עקב ביטוי דולף. ביטוי דולף מתרחש כתוצאה מפוטנציאל קשירה מובנה בין rtTA לרצפי Otet בהיעדר דוקסיציקלין, ופעילות שיורית של הטרנסג’ן Otet בהיעדר rtTA (נבדק^ב-34). ביטוי דולף מייצג חולשה אחת של מערכות Tet, ואף על פי שהדליפה היא לעתים קרובות חיסרון מקובל על המערכת, מצבים שבהם הביטוי הדולף יכול להוביל לרעילות ותמותה, כגון עם רעלן דיפתריה (DTA) בחיות Otet-DTA יכולים להגביל את השימוש במערכות אלה³⁵.

עיבוד מוח, חתך ואימונופלואורסצנציה של מקטעים דקים למיקרוסקופיה
כדי לנתח את מוחותיהם של עכברים לאחר ניסוי מעקב אחר שושלת, יש להחדיר תחילה עכברים באמצעות עירוי טרנסקרדיאלי כדי להסיר דם ו- CSF שיכולים להוביל לפלואורסצנציה אוטו-פלואורסצנטית גבוהה במוח. ישנם שני מקבעים נפוצים שהחיה עשויה להיות חדורתם אליהם: מקבע רקמת היסטוכואיצה, מקבע גליוקסלי (GF), או 4% פרפורמלדהיד (PFA). קיבועים גליוקסלים מאפשרים תהליך קיבוע עדין יחסית עם פחות קישורים צולבים מאשר PFA. זה מפחית את נוקשות הרקמות, מפחית את הצורך בשליפת אנטיגן, ומאפשר פתרונות נוגדנים פחות מרוכזים במהלך חיסון. עם זאת, אם הם מכילים מתנול זה עשוי לשמש להגברת autofluorescence³⁶. מצד שני, PFA יאפשר לעתים קרובות קיבוע חזק יותר, ובעוד שאחזור אנטיגן יידרש במהלך חיסון, ישנם נוגדנים שיעבדו רק עם רקמות קבועות PFA, וזלוף עם 4% PFA נדרש עבור טכניקת הסליקה האופטית שתואר מאוחר יותר.

מעקב אחר פרפוזיה הוא שלב שלאחר הקיבעון, שבו המוחות שקועים באותו סוג של קיבוע המשמש במהלך הזלוף במהלך הלילה. זה מאפשר לכל אזורי המוח שאולי לא תוקנו במלואם במהלך הזלוף להמשיך לתקן. לאחר מכן, המוחות ידוגרו בסוכרוז בסוכרוז במי מלחים מוחזקים בפוספט (PBS) כדי להסיר כמה שיותר מים לפני שלב ההקפאה כדי למנוע היווצרות קרח בתוך הרקמה (“שימור קריו”). לאחר מכן ניתן לחתוך את המוחות לכל מספר של מקטעי רקמות סגיטליים, קורונליים או רוחביים לצורך עיבוד. הן מבחינת הדיוק והן מבחינת יכולת השכפול, יש להשתמש בבלוקים מכוילים של המוח באופן שיבטיח חתכי ברגמא עקביים בין בעלי חיים. הגורם החשוב ביותר שיכול להשפיע על אופן חתך המוח הוא אזורי המוח המעניינים. לדוגמה, בעוד שחתך סגיטלי עשוי לאפשר לנתח יותר אזורי מוח בקטע רקמה אחד, חתך זה לא יאפשר ניתוח של אזורים נוירו/גליוגניים של האזור התת-חדרי החדרי (V-SVZ) מכיוון שהצדדים הצדדיים והמדיאליים של החדר הצדדי יהיו בלתי ניתנים להבחנה במימד זה והם נצפים טוב יותר במישור הקורונלי. זו יכולה להיות הבחנה חשובה שיש לעשות במחקרי נוירוגנזה למבוגרים, שכן הצד הצדדי של החדר הצדדי מכיל את V-SVZ הנוירוגני, בעוד שהדופן המדיאלית של החדר הצדדי היא נישה גליוגנית יותר³⁷.

לאחר שהרקמות חולקו למקטעים קורונליים, סגיטליים או רוחביים, הן יוקפאו לבלוקים באמצעות תמיסת הטבעה אופטימלית של טמפרטורת קירור (OCT). כאן, המוחות קפואים בתוך החומר המטביע הזה, עם שימוש בתערובת של קרח יבש ואתנול. אם נדרש ניתוח מקטע דק, בלוקים ייפרסו על קריוסטאט, ובהתאם לניתוח במורד הזרם הנדרש ניתן לדבוק בשקופיות זכוכית טעונות חיובית כמקטעים דקים (<20 מיקרומטר). ניתן להשתמש גם בשקופיות זכוכית שאינן טעונות, אך השימוש בשקופיות לא טעונות עלול לגרום לרקמות להתנתק מהשקופיות³⁸. אם נדרשים מקטעי רקמה צפים חופשיים בעובי בינוני (>20 מיקרומטר), הרקמות ייאספו כמקטעים צפים חופשיים. אם נדרשים חלקים עבים (0.5-4 מ”מ), נדרש חיתוך של מקטעי מוח שאינם קפואים עם ויברטום. חשוב לציין את הבדלי האחסון בין מקטעי האחסון בשקופיות, הדורשים הקפאה בטמפרטורה של -20 עד -80 מעלות צלזיוס ומקטעים צפים חופשיים, אשר יאוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

ניקוי מוח ומיקרוסקופיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית שלמה
אם רוצים ניתוח רחב יותר, אך פחות מפורט, של התאים שעוקבים אחר שושלת במוח העכבר, ניתוח מקיף של מקטעים עבים יותר של רקמת המוח אפשרי עם ניקוי מוח iDISCO³⁹ ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית של אימונוסטיזציה ואריחים של z-stack או מיקרוסקופיה של יריעות אור. כאן, חלקים גדולים של מוח העכבר יפונו אופטית (תהליך של דליפידציה³⁹), מה שמאפשר טוב יותר הדמיית אותות פלואורסצנטיים על פני קטע רקמה של 1 מ”מ. החסרונות של תהליך זה הם אוטופלואורסצנציה גבוהה ויכולת מופחתת להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה של תאים וניתוח מפורט של צביעה משותפת בשל מרחקי העבודה המוגדלים הנדרשים בהשוואה לשיטות מסורתיות יותר (קריוזקציות דקות או מקטעים צפים חופשיים). מסיבה זו, אנו ממליצים על ניקוי המוח כדי לנתח את תוצאות מעקב השושלת בקנה מידה גדול באזורי מוח מרובים, במקום לנסות לאפיין או לנתח תאים בודדים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מדינת אוהיו. 1. יצירת שושלת המתחקה אחר קו עכברי טט-און, אסטרטגיות רבייה וגנוטיפ עבור עכברי קוהורט ניסיוני הערה: כאן, אנו מתארים את היצירה של מערכת עכבר Tet-On עם…

Representative Results

בעוד שהאות הפלואורסצנטי הנובע ממערכת Tet-On עם כתב פלואורסצנטי ישתנה בהתאם למקדם העניין ולפלואורופור(ים) שבו נעשה שימוש, נתאר כיצד ניתחו ממצאים עם mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG בעלי חיים. ניתוח של מוחות בוגרים לאחר מרדף דופק הביא לתאים המבטאים GFP בממברנה בנישות אנטומיות שונות. יש לציין את ההבדל בעוצמת הפ…

Discussion

מתוארת שיטה ליצירה, ניצול וניתוח של שושלת משולשת מהונדסת המתחקה אחר קו עכברים המסמנת תאי גזע בתוך מוח העכבר הבוגר in vivo. בשילוב עם חיסון או ניקוי מוחי, ניתן לבצע זיהוי ואפיון של תאים פלואורסצנטיים במעקב ברחבי המוח. טכניקה זו מציעה את היכולת להבין את פוטנציאל הפלסטיק/התחדשות/שיפוץ של תא?…

Materials

Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx