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Biologie

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

Published: July 27, 2022
doi:
10.3791/64028
, , , ,
1Department of Medicine,Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics,Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

El tracto gastrointestinal es uno de los órganos más sensibles a las lesiones en los tratamientos radioterapéuticos contra el cáncer. Es simultáneamente un sistema de órganos con una de las capacidades regenerativas más altas después de tales insultos. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Abstract

El epitelio intestinal consiste en una sola capa de células, pero contiene múltiples tipos de células terminalmente diferenciadas, que se generan por la proliferación activa de células madre intestinales ubicadas en la parte inferior de las criptas intestinales. Sin embargo, durante los eventos de lesión intestinal aguda, estas células madre intestinales activas experimentan la muerte celular. La irradiación gamma es un tratamiento contra el cáncer colorrectal ampliamente utilizado que, aunque terapéuticamente eficaz, tiene el efecto secundario de agotar el conjunto activo de células madre. De hecho, los pacientes con frecuencia experimentan síndrome de radiación gastrointestinal mientras se someten a radioterapia, en parte debido al agotamiento activo de las células madre. La pérdida de células madre intestinales activas en criptas intestinales activa un conjunto de células madre intestinales de reserva típicamente quiescentes e induce la desdiferenciación de las células secretoras y precursoras de enterocitos. Si no fuera por estas células, el epitelio intestinal carecería de la capacidad de recuperarse de la radioterapia y otros insultos tisulares importantes. Los nuevos avances en las tecnologías de rastreo de linaje permiten el seguimiento de la activación, diferenciación y migración de las células durante la regeneración y se han empleado con éxito para estudiar esto en el intestino. Este estudio tiene como objetivo representar un método para el análisis de las células dentro del epitelio intestinal del ratón después de una lesión por radiación.

Introduction

El epitelio intestinal humano cubriría aproximadamente la superficie de la mitad de una cancha de bádminton si se colocara completamente plano1. En cambio, esta capa de una sola célula que separa a los humanos del contenido de sus intestinos se compacta en una serie de proyecciones en forma de dedos, vellosidades y hendiduras, criptas que maximizan el área de superficie de los intestinos. Las células del epitelio se diferencian a lo largo de un eje cripta-vellosidad. Las vellosidades consisten principalmente en enterocitos que absorben nutrientes, células caliciformes secretoras de moco y células enteroendocrinas productoras de hormonas, mientras que las criptas consisten principalmente en células de Paneth productoras de defensina, células madre activas y de reserva, y células progenitoras 2,3,4,5. Además, la comunicación bidireccional que estas células tienen con las células estromales e inmunes del compartimiento mesenquimal subyacente y la microbiota de la luz generan una compleja red de interacciones que mantiene la homeostasis intestinal y es crítica para la recuperación después de una lesión 6,7,8.

El epitelio intestinal es el tejido que se auto-renueva más rápidamente en el cuerpo humano, con una tasa de renovación de 2-6 días 9,10,11. Durante la homeostasis, las células madre activas en la base de las criptas intestinales (células columnares de la base de la cripta), marcadas por la expresión del receptor acoplado a proteína G 5 rico en leucina (LGR5), se dividen rápidamente y proporcionan células progenitoras que se diferencian en todos los demás linajes epiteliales intestinales. Sin embargo, debido a su alta tasa mitótica, las células madre activas y sus progenitores inmediatos son particularmente sensibles a la lesión por radiación gamma y sufren apoptosis después de la irradiación 5,12,13,14. Tras su pérdida, las células madre de reserva y las células no madre (subpoblación de progenitores y algunas células terminalmente diferenciadas) dentro de las criptas intestinales se activan y reponen el compartimiento de la cripta basal, que luego puede reconstituir las poblaciones celulares de las vellosidades y, por lo tanto, regenerar el epitelio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreo de linaje, múltiples grupos de investigación han demostrado que las células madre de reserva (quiescentes) son capaces de apoyar la regeneración tras la pérdida de células madre activas 13,16,17,18,19,20,21,22. Estas células se caracterizan por la presencia del oncogén de la proteína 1 del complejo polycomb (Bmi1), el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa de ratón (mTert), el homeobox del lúpulo (Hopx) y el gen de la proteína 1 de repetición rica en leucina (Lrig1). Además, se ha demostrado que las células no madre son capaces de reponer las criptas intestinales tras una lesión 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particular, se ha demostrado que los progenitores de células secretoras y enterocitos sufren desdiferenciación tras una lesión, vuelven a células madre y apoyan la regeneración del epitelio intestinal. Estudios recientes han identificado células que expresan múltiples marcadores que poseen la capacidad de adquirir características similares a las de un tallo tras una lesión (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. demostraron que incluso las células maduras de Paneth (LYZ+) pueden contribuir a la regeneración intestinal37. Además, además de causar apoptosis de las células epiteliales intestinales y alterar la función de barrera epitelial, la irradiación resulta en disbiosis de la flora intestinal, activación de células inmunes y el inicio de una respuesta proinflamatoria, y la activación de células mesenquimales y estromales38,39.

La radiación gamma es una valiosa herramienta terapéutica en el tratamiento del cáncer, especialmente para los tumores colorrectales40. Sin embargo, la irradiación afecta significativamente la homeostasis intestinal al inducir daño a las células, lo que conduce a la apoptosis. La exposición a la radiación causa múltiples perturbaciones que ralentizan la recuperación de un paciente y se caracteriza por lesiones de la mucosa e inflamación en la fase aguda y diarrea, incontinencia, sangrado y dolor abdominal a largo plazo. Esta panoplia de manifestaciones se conoce como toxicidad por radiación gastrointestinal. Además, la progresión inducida por la radiación de la fibrosis transmural y/o la esclerosis vascular sólo puede manifestarse años después del tratamiento38,41. Simultáneamente a la lesión misma, la radiación induce una respuesta de reparación en las células intestinales que activa las vías de señalización responsables de iniciar y orquestar la regeneración42. La enfermedad del intestino delgado inducida por radiación puede originarse a partir de la radioterapia pélvica o abdominal administrada a otros órganos (como cuello uterino, próstata, páncreas, recto)41,43,44,45,46. La lesión por irradiación intestinal es, por lo tanto, un problema clínico importante, y es probable que una mejor comprensión de la fisiopatología resultante avance en el desarrollo de intervenciones para aliviar las complicaciones gastrointestinales asociadas con la radioterapia. Existen otras técnicas que permiten investigar el propósito regenerativo del epitelio intestinal aparte de la radiación. Se han desarrollado modelos murinos transgénicos y químicos para estudiar la inflamación y la regeneración posterior47. El sulfato de sodio de dextrano (DSS) induce inflamación en el intestino y conduce al desarrollo de características similares a las de la enfermedad inflamatoria intestinal48. Una combinación del tratamiento DSS con el compuesto procancerígeno azoximetano (OMA) puede resultar en el desarrollo de cáncer asociado a colitis48,49. La lesión inducida por isquemia por reperfusión es otro método empleado para estudiar el potencial regenerativo del epitelio intestinal. Esta técnica requiere experiencia y conocimientos quirúrgicos50. Además, las técnicas antes mencionadas causan diferentes tipos de lesiones que la radiación y pueden conducir a la participación de diferentes mecanismos de regeneración. Además, estos modelos consumen mucho tiempo, mientras que la técnica de radiación es bastante breve. Recientemente, los métodos in vitro que utilizan enteroides y colonoides generados a partir del intestino y el colon se han utilizado en combinación con lesiones por radiación para estudiar los mecanismos de regeneración intestinal51,52. Sin embargo, estas técnicas no recapitulan completamente el órgano que modelan53,54.

El protocolo presentado incluye la descripción de un modelo murino de lesión por radiación gamma en combinación con un modelo genético que, después del tratamiento con tamoxifeno, permite rastrear linajes originados en la población de células madre de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Este modelo utiliza una irradiación corporal total de 12 Gy, que induce una lesión intestinal lo suficientemente significativa como para activar las células madre de reserva, al tiempo que permite la investigación posterior de la capacidad regenerativa intestinal dentro de los 7 días posteriores a la lesión55.

Protocol

Todos los ratones fueron alojados en la División de Recursos para Animales de Laboratorio (DLAR) de la Universidad de Stony Brook. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC) aprobó todos los estudios y procedimientos que involucran sujetos animales. Los experimentos con sujetos animales se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con el protocolo aprobado de manejo de animales (IACUC # 245094). NOTA: Las cepas de ratón B6;129-Bmi1 tm1(cre/…

Representative Results

El uso de irradiación corporal total (LCT) de 12 Gy en combinación con el rastreo del linaje genético murino permite un análisis exhaustivo de las consecuencias de la lesión por radiación en el intestino. Para empezar, Bmi1-CreER; Los ratonesRosa26 eYFP recibieron una sola inyección de tamoxifeno, que induce la expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) dentro de una población de células madre de reserva Bmi1 + . Dos días después de la inyección de …

Discussion

Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Permite el análisis preciso de los cambios en el epitelio intestinal en el transcurso de 7 días después de la lesión. Es importante destacar que los puntos de tiempo seleccionados reflejan etapas cruciales de la lesión y se caracterizan por distintas alteraciones en el intestino (fases de lesión, apoptosis, regeneración y normalización)60. Este modelo de irradiación ha sido establecido y evaluado cuidadosa…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Núcleo de Investigación de Histología del Centro de Cáncer de Stony Brook por la asistencia experta con la preparación de muestras de tejido y a la División de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Stony Brook por su asistencia con el cuidado y manejo de animales. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DK124342 otorgadas a Agnieszka B. Bialkowska y DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Materials

1 mL syringe BD 309659 –
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 –
27G x 1/2" needle BD 305109 –
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 –
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 –
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 –
Corn oil Millipore-Sigma C8267 –
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 –
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV –
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. – 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 –
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 –
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 –
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT –
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 –
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).
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