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Espectrometria de massa de hidrogênio/deutério-deutério para o estudo da dinâmica estrutural alfa-sinucleína sob condições fisiológicas

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64050
,
1Living Systems Institute, Department of Biosciences,University of Exeter

Summary

O conjunto estrutural da alfa-sinucleína monomérica afeta sua função fisiológica e propriedades fisiológicas. O presente protocolo descreve como realizar espectrometria de massa de milissegundos de hidrogênio/deutério e análises subsequentes de dados para determinar informações conformais sobre o monômero dessa proteína intrinsecamente desordenada em condições fisiológicas.

Abstract

Alfa-sinucleína (aSyn) é uma proteína intrinsecamente desordenada cujos agregados fibrilares são abundantes em corpos e neuridos de Lewy, que são as marcas da doença de Parkinson. No entanto, grande parte de sua atividade biológica, bem como sua agregação, envolve centralmente a forma de monômero solúvel da proteína. A elucidação dos mecanismos moleculares da biologia e da fisiopatologia requer métodos estruturalmente altamente resolvidos e é sensível às condições biológicas. Suas estruturas nativamente desdobradas e meta-estáveis tornam o aSyn monoméico intratável a muitas técnicas de biologia estrutural. Aqui, a aplicação de uma dessas abordagens é descrita: espectrometria de massa de hidrombútrio/deutério(HDX-MS) na escala de tempo de milissegundos para o estudo de proteínas com baixa estabilidade termodinâmica e fatores fracos de proteção, como aSyn. Na escala de tempo de milissegundos, os dados HDX-MS contêm informações sobre a acessibilidade solvente e a estrutura ligada a hidrogênio de aSyn, que são perdidas em tempos de rotulagem mais longos, resultando em resolução estrutural até o nível de aminoácido. Portanto, o HDX-MS pode fornecer informações em altas resoluções estruturais e temporais sobre dinâmica conformacional e termodinâmica, interações intra e intermárgidas, e o impacto estrutural de mutações ou alterações às condições ambientais. Embora amplamente aplicável, é demonstrado como adquirir, analisar e interpretar medidas milissegundos de HDX-MS em aSyn monomérica.

Introduction

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas em todo o mundo1. Caracteriza-se pela formação de inclusões citoplasmáticas conhecidas como corpos de Lewy e neurites de Lewy na região substantia nigra pars compacta do cérebro. Essas inclusões citoplasmáticas têm sido encontradas para conter agregados da proteína intrinsecamente desordenada aSyn2. Em DP e outras sinucleinopatias, aSyn se transforma de um estado solúvel desordenado em um estado doente insolúvel e altamente estruturado. Em sua forma nativa, o monoméico aSyn adota uma ampla gama de conformações estabilizadas por interações eletrostáticas de longo alcance entre suas interações N e C-termini e hidrofóbicas entre sua região de componente beta C-terminus e não amiloide (NAC) 3,4,5,6. Quaisquer interrupções nessas interações estabilizadoras, como mutações, modificações pós-translacionais e mudanças no ambiente local, podem levar ao descompos do monômero, desencadeando assim o processo de agregação7.

Embora exista uma vasta quantidade de pesquisa sobre as formas oligomeméricas e fibrilares de aSyn 8,9,10,11, há uma necessidade crucial de estudar a forma monomérica da proteína e entender melhor quais conformadores são funcionais (e como) e que são propensos a agregar 8,9,10,11 . Sendo intrinsecamente desordenado, apenas 14 kDa de tamanho, e difícil de cristalizar, o monômero aSyn não é favorável à maioria das técnicas biológicas estruturais. No entanto, uma técnica capaz de medir a dinâmica conformacional do aSyn monomérico é o milissegundo HDX-MS, que recentemente gerou observações estruturais importantes que seriam desafiadoras ou impossíveis de obter de outra forma 12,13,14. Milissegundos HDX-MS mede sensivelmente a média do conjunto conformacional da proteína monitorando a troca isotópica em hidrogênios amidos, indicando acessibilidade solvente e participação de rede de ligação de hidrogênio de uma determinada região proteica na escala de tempo de milissegundos. É necessário enfatizar o aspecto milissegundo do HDX-MS, pois, devido à sua natureza nativamente desdobrada e meta-estável, aSyn exibe cinética de troca de hidrogênio muito rápida que se manifestam bem abaixo do limite inferior dos sistemas HDX-MS convencionais. Por exemplo, a maioria da molécula de ASyn tem completamente trocado hidrogênio por deutério sob condições intracelulares em menos de 1 s. Vários laboratórios já construíram uma instrumentação de mistura rápida; neste caso, um protótipo de instrumento de fluxo de sada rápida capaz de executar HDX-MS com um tempo morto de 50 ms e uma resolução temporal de 1 ms é usado15. Embora o MILISSEGUD HDX-MS tenha sido recentemente extremamente importante no estudo da ASyn, é valioso estudar proteínas/regiões intrinsecamente desordenadas de forma mais ampla e um grande número de proteínas com laços/regiões que são apenas fracamente estáveis. Por exemplo, drogas de peptídeos (por exemplo, insulina; GLP-1/glucagon; proteínas de fusão de tirzepatidas) e peptídeos (por exemplo, o inibidor do HIV FN3-L35-T1144) são os principais formatos de drogas onde informações estruturais e de estabilidade em fase de solução podem ser uma entrada crítica para decisões de desenvolvimento de medicamentos, e, ainda assim, a moiety peptídeo é muitas vezes apenas fracamente estável e intratável pelo HDX-MS na escala de tempo de segundos 16,17,18,19,20 . Métodos emergentes de HDX-MS com rotulagem nos domínios de segundos/minutos têm sido mostrados para obter informações estruturais para G-quadruplexes de DNA, mas deve ser possível estender isso a estruturas oligonucleotídeos mais diversas pela aplicação de milissegundos HDX-MS21.

Os experimentos HDX-MS podem ser realizados em três níveis diferentes: (1) de baixo para cima (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolítico), (2) de baixo para baixo (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolyticamente, e os peptídeos resultantes são fragmentados ainda mais por técnicas de fragmentação suave) e (3) de cima para baixo (pelo qual as técnicas de fragmentação macia são diretamente fragmentadas a proteína rotulada) 22 . Assim, os dados sub-moleculares do HDX-MS permitem-nos localizar o comportamento de troca para regiões específicas de uma proteína, tornando-se fundamental ter cobertura de sequência adequada para tais experimentos. A resolução estrutural de qualquer experimento HDX-MS baseia-se no número de peptídeos ou fragmentos protelíticos derivados da proteína após a digestão ou fragmentação suave, respectivamente. Em cada um dos três tipos de experimentos descritos acima, a mudança na troca de amide em cada peptídeo/fragmento é mapeada de volta à estrutura primária da proteína para indicar o comportamento das regiões localizadas da proteína. Embora a maior resolução estrutural seja alcançada através da fragmentação suave, a descrição desses experimentos está fora do escopo do presente estudo, que se concentra na medição de conformações monômeros de aSyn. Excelentes resultados podem ser obtidos com o fluxo de trabalho “de baixo para cima” comumente aplicado descrito aqui.

Aqui, são fornecidos procedimentos sobre (1) como preparar e lidar com amostras de ASyn e buffers HDX-MS, (2) como realizar mapeamento de peptídeos para um experimento HDX-MS de baixo para cima, (3) como adquirir dados HDX-MS sobre ayn monomérica em condições fisiológicas, especificamente no domínio de tempo milissegundo (usando um instrumento personalizado; instrumentos alternativos para rotulagem de milisse e (4) como processar e analisar os dados do HDX-MS. Métodos que utilizam aSyn monomérica em pH fisiológico (7.40) em duas condições de solução são exemplificados aqui. Embora criticamente úteis no estudo de aSyn, esses procedimentos podem ser aplicados a qualquer proteína e não se limitam a proteínas intrinsecamente desordenadas.

Protocol

1. Expressão proteica e purificação de aSyn Prepare aSyn após um relatório publicado anteriormente9. Dialisar em um buffer de armazenamento seguro (por exemplo, Tris, pH 7.2 ). Se necessário, concentre a amostra (por exemplo, tubos de microcentrifuuge do filtro de spin usando 3 kDa MWCO, 14.000 x g por aproximadamente 10-30 min, ver Tabela de Materiais).NOTA: É aconselhável não se concentrar excessivamente. A int…

Representative Results

Devido à sua natureza intrinsecamente desordenada, é difícil capturar as intrincadas mudanças estruturais em aSyn no pH fisiológico. HDX-MS monitora a troca isotópica em hidrogênios de amido backbone, sondando a dinâmica e interações conformais da proteína. É uma das poucas técnicas para adquirir essas informações em altas resoluções estruturais e temporais. Este protocolo é amplamente aplicável a uma ampla gama de proteínas e condições de tampão, e isso é exemplificado pela medição da cinética…

Discussion

No presente artigo, são descritos os seguintes procedimentos: (1) a realização de experimentos de mapeamento de peptídeos em aSyn monomérica para obter a maior cobertura de sequência, (2) aquisição de dados milissegundos HDX-MS sobre a aSyn monomérica em condições fisiológicas e (3) a realização da análise e interpretação dos dados de HDX-MS resultantes. Os procedimentos fornecidos são geralmente simples de executar, cada experimento de rotulagem normalmente dura apenas cerca de 8h para três réplicas …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A NS é financiada pela Bolsa de Estudos do Jubileu de Diamante do Conselho Universitário. A JJP é apoiada por uma Ukri Future Leaders Fellowship [Número de subvenção: MR/T02223X/1].

Materials

1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column
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Referenzen

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Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).
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