ボレリエラ(ボレリア)ブルグドルフェリの必須成分 in vitro転写アッセイ
Summary
インビトロ 転写アッセイは、 ボレリエラ・ブルグドルフェリにおける転写調節のメカニズムを解読することができる。このプロトコルでは、 B. burgdorferi RNAポリメラーゼを精製し、 in vitro 転写反応を実行する手順について説明します。 in vitro 転写アッセイを用いた実験的アプローチでは、活性RNAポリメラーゼの信頼性の高い精製と保存が必要です。
Abstract
ボレリエラ・ブルグドルフェリは、代謝およびゲノムレパートリーが限られている細菌性病原体です。B. burgdorferiは脊椎動物とマダニの間を細胞外に通過し、感染中に異なる環境で生き残るためにその転写プロファイルを劇的に再構築します。B. burgdorferi研究の焦点は、細菌が転写変化を通じてその環境にどのように反応するかを明確に理解することです。in vitro転写アッセイは、転写調節の基本的なメカニズムを生化学的に解剖することを可能にします。ここでは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの精製と保存、シグマ因子の精製、DNAテンプレートの生成、およびin vitro転写アッセイを説明する詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)から精製されたRNAポリメラーゼの使用を記載している。5A4-RpoCは、RNAポリメラーゼの最大サブユニットをコードするrpoC遺伝子に10XHisタグを有する、以前に発表された株です。インビトロ転写アッセイは、株5A4-RpoCから精製されたRNAポリメラーゼ、ハウスキーピングシグマ因子RpoDの組換えバージョン、およびPCRで生成された二本鎖DNAテンプレートで構成されています。in vitro転写アッセイを組み立てるためのタンパク質精製技術とアプローチは概念的によく理解されており、比較的一般的ですが、RNAポリメラーゼの取り扱いに関する考慮事項は生物ごとに異なることがよくあります。ここで紹介するプロトコルは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの酵素研究用に設計されています。この方法は、RNAポリメラーゼの活性に対する転写因子、プロモーター、および翻訳後修飾の役割を試験するために適合させることができる。
Introduction
ライム病と再発熱は、ボレリア属とボレリエラ属のスピロヘータ病原体によって引き起こされます1,2,3。ライム病は北米で著名なベクター媒介性疾患であり、その結果、ボレリエラ・ブルグドルフェリはスピロヘータ生物学を研究するための著名なモデル生物です4,5。B. burgdorferiの転写調節機構の調査は、ダニベクターと哺乳類宿主の間を循環する際の環境の変化への適応をよりよく理解することを目的としています6,7。pH、温度、浸透圧、栄養素の利用可能性、短鎖脂肪酸、有機酸、溶存酸素および二酸化炭素レベルの変化は、B. burgdorferiがその節足動物ベクターで生存し、動物に感染するために重要な遺伝子の発現を調節します8,9,10,11,12,13,14,15、16、17、18。刺激に対するこれらの反応を調節メカニズムと結びつけることは、B. burgdorferi研究の重要な側面でした19。
転写因子とシグマ因子は、細胞プロセスを実行する遺伝子の転写を制御します。ライムと再発熱のスピロヘータは、比較的まばらな転写因子と代替シグマ因子のセットを持っています。それにもかかわらず、環境に対するB.ブルグドルフェリ応答を指示する複雑な転写変化があります20,21,22。環境変化に応答してB. burgdorferiの転写変化を引き起こす特定のメカニズムは不明のままである。in vitro転写アッセイは、転写因子およびシグマ因子の機能と調節機構をアッセイするための生化学的アプローチを採用するための強力なツールです23、24、25、26。
B. burgdorferi RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写アッセイ系が最近確立されました24。細菌はしばしば独特の細胞生理学を持っているので、異なる種と属のRNAポリメラーゼは、酵素精製、酵素貯蔵、および反応緩衝条件に対して異なる反応を示します27。B. burgdorferiはまた、RNAポリメラーゼが研究されている多くの細菌種から遺伝的に離れています20。溶解、洗浄、および溶出バッファー条件、保存バッファー、in vitro転写反応バッファー、およびアッセイ構築方法などの酵素調製の態様はすべて、RNAポリメラーゼ活性を変化させる可能性があります。ここでは、RNAポリメラーゼとシグマ因子RpoDの精製、線状二本鎖DNAテンプレートの作成、およびこのシステムを使用するラボ間の再現性を促進するためのin vitro転写アッセイの構築のためのプロトコルを提供します。RpoD依存性転写の線形範囲を実証するために反応例を詳述し、このアプローチの限界と代替案について説明します。
Protocol
1. RNAポリメラーゼの精製とRNAポリメラーゼ原液の調製 前述の細胞収集プロトコル28,29を使用して、微好気性環境(34°C、5%CO2、3%O2)でBSKII培地で培養した2〜4 LのB.ブルグドルフェリRpoC-His10Xから2〜4 x 107細胞/ mLの密度まで細胞ペレットを収集します。500 mL遠心ボトルで10,000 x g、4°Cで30分間遠心?…
Representative Results
反応の制限段階がシグマ因子を介した転写開始である in vitro 転写反応では、転写活性はシグマ因子の量とともに直線的に増加するはずです。RNA産物への放射性標識ヌクレオチドの取り込みから生じる変化するシグナルを観察するために、2つの濃度のRNAポリメラーゼとともにさまざまなRpoD濃度をテストする in vitro 転写実験の準備を紹介します。RNAポリメラーゼ、RpoD、および二?…
Discussion
提示されたプロトコルを使用して構築されたインビトロ転写アッセイは、最近、B. burgdorferiにおける転写因子の役割を研究するために使用され、他の転写因子、シグマ因子、および分子を使用して同様の実験を構築するために適用できます23。B. burgdorferiから活性RNAポリメラーゼが得られ、その活性が検出されると、in vitro転写アッセイ内の成分お?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、クレイトン大学の健康科学戦略的投資基金教員開発助成金によってサポートされました。B. burgdorferi RpoC-His10X株は、モンタナ大学のD. Scott Samuels博士から親切に提供されました。マルトース結合タンパク質タグ付きrpoD対立遺伝子をコードするpMAL-C5Xプラスミドを有する大腸菌株は、NIAID、NIH、ロッキーマウンテンラボラトリーズのフランクゲラルディーニ博士から親切に提供されました。
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
Referenzen
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
Diesen Artikel zitieren
Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).