Основные компоненты анализов транскрипции Borreliella (Borrelia) burgdorferi in vitro
Summary
Анализы транскрипции in vitro могут расшифровать механизмы регуляции транскрипции у Borreliella burgdorferi. Этот протокол описывает этапы очистки РНК-полимеразы B. burgdorferi и проведения реакций транскрипции in vitro. Экспериментальные подходы с использованием анализов транскрипции in vitro требуют надежной очистки и хранения активной РНК-полимеразы.
Abstract
Borreliella burgdorferi — бактериальный патоген с ограниченным метаболическим и геномным репертуаром. B. burgdorferi проходит внеклеточно между позвоночными и клещами и резко реконструирует свой транскрипционный профиль, чтобы выжить в разрозненных средах во время инфекции. Основное внимание в исследованиях B. burgdorferi уделяется четкому пониманию того, как бактерии реагируют на окружающую среду посредством транскрипционных изменений. Анализы транскрипции in vitro позволяют биохимически препарировать основные механизмы регуляции транскрипции. Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий очистку и хранение РНК-полимеразы B. burgdorferi , очистку сигма-фактора, генерацию матрицы ДНК и анализы транскрипции in vitro . В протоколе описано использование РНК-полимеразы, очищенной от B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC представляет собой ранее опубликованный штамм, содержащий 10XHis-метку на гене rpoC , кодирующую самую большую субъединицу РНК-полимеразы. Анализы транскрипции in vitro состоят из РНК-полимеразы, очищенной от штамма 5A4-RpoC, рекомбинантной версии домашнего сигма-фактора RpoD и двухцепочечной матрицы ДНК, сгенерированной ПЦР. В то время как методы очистки белка и подходы к сборке анализов транскрипции in vitro концептуально хорошо изучены и относительно распространены, соображения обработки РНК-полимераз часто различаются от организма к организму. Представленный здесь протокол предназначен для ферментативных исследований РНК-полимеразы B. burgdorferi. Метод может быть адаптирован для проверки роли транскрипционных факторов, промоторов и посттрансляционных модификаций на активность РНК-полимеразы.
Introduction
Болезнь Лайма и возвратный тиф вызываются возбудителями спирохет родов Borrelia и Borreliella 1,2,3. Болезнь Лайма является известным трансмиссивным заболеванием в Северной Америке, и, следовательно, Borreliella burgdorferi является выдающимся модельным организмом для изучения биологии спирохеты 4,5. Исследования механизмов регуляции транскрипции B. burgdorferi направлены на то, чтобы лучше понять его адаптацию к изменениям в окружающей среде, когда он циклически переключается между своим клещом-переносчиком и хозяевами млекопитающих 6,7. Изменения рН, температуры, осмолярности, доступности питательных веществ, короткоцепочечных жирных кислот, органических кислот и уровней растворенного кислорода и углекислого газа модулируют экспрессию генов, которые важны для выживания B. burgdorferi в его членистоногом векторе и заражения животных 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Связь этих реакций на стимулы с регуляторными механизмами была важным аспектом исследования B. burgdorferi 19.
Транскрипционные факторы и сигма-факторы контролируют транскрипцию генов, осуществляющих клеточные процессы. Спирохеты болезни Лайма и возвратного тифа содержат относительно редкий набор транскрипционных факторов и альтернативных сигма-факторов. Несмотря на это, существуют сложные транскрипционные изменения, направляющие реакцию B. burgdorferi на окружающую среду20,21,22. Конкретные механизмы, приводящие к транскрипционным изменениям у B. burgdorferi в ответ на изменения окружающей среды, остаются неясными. Транскрипционные анализы in vitro являются мощными инструментами для использования биохимического подхода к анализу функции и регуляторных механизмов транскрипционных факторов и сигма-факторов23,24,25,26.
Недавно была создана система анализа транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы B. burgdorferi 24. Поскольку бактерии часто имеют уникальную клеточную физиологию, РНК-полимеразы разных видов и родов по-разному реагируют на очистку ферментов, хранение ферментов и условия буфера реакции27. B. burgdorferi также генетически далек от многих видов бактерий, у которых были изучены РНК-полимеразы20. Аспекты ферментной подготовки, такие как условия буфера лизиса, промывки и элюирования, буфер хранения, буфер реакции транскрипции in vitro и метод построения анализа, могут изменять активность РНК-полимеразы. Здесь мы предлагаем протокол очистки РНК-полимеразы и сигма-фактора RpoD, получения линейной двухцепочечной матрицы ДНК и построения анализов транскрипции in vitro для облегчения воспроизводимости между лабораториями, использующими эту систему. Мы подробно описываем пример реакции, чтобы продемонстрировать линейный диапазон для RpoD-зависимой транскрипции, и обсуждаем ограничения и альтернативы этому подходу.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализы транскрипции in vitro, построенные с использованием представленного протокола, недавно были использованы для изучения роли транскрипционного фактора у B. burgdorferi и могут быть применены для построения аналогичных экспериментов с использованием других транскрипционных фа…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Фонда стратегических инвестиций в области здравоохранения Крейтонского университета. Штамм B. burgdorferi RpoC-His10X был любезно предоставлен доктором Д. Скоттом Сэмюэлсом из Университета Монтаны. Штамм E. coli , содержащий плазмиду pMAL-C5X, кодирующую аллель rpoD , меченный мальтозосвязывающим белком, был любезно предоставлен доктором Фрэнком Герардини из Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
Referenzen
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
