Componentes esenciales de los ensayos de transcripción in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi
Summary
Los ensayos de transcripción in vitro pueden descifrar los mecanismos de regulación transcripcional en Borreliella burgdorferi. Este protocolo describe los pasos para purificar la ARN polimerasa de B. burgdorferi y realizar reacciones de transcripción in vitro. Los enfoques experimentales que utilizan ensayos de transcripción in vitro requieren una purificación y almacenamiento confiables de ARN polimerasa activa.
Abstract
Borreliella burgdorferi es un patógeno bacteriano con repertorios metabólicos y genómicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados y garrapatas y remodela dramáticamente su perfil transcripcional para sobrevivir en ambientes dispares durante la infección. Un enfoque de los estudios de B. burgdorferi es comprender claramente cómo la bacteria responde a su entorno a través de cambios transcripcionales. Los ensayos de transcripción in vitro permiten diseccionar bioquímicamente los mecanismos básicos de regulación transcripcional. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe la purificación y almacenamiento de la polimerasa de ARN de B. burgdorferi , la purificación del factor sigma, la generación de plantillas de ADN y los ensayos de transcripción in vitro . El protocolo describe el uso de ARN polimerasa purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC es una cepa previamente publicada que alberga una etiqueta 10XHis en el gen rpoC que codifica la subunidad más grande de la ARN polimerasa. Los ensayos de transcripción in vitro consisten en la ARN polimerasa purificada de la cepa 5A4-RpoC, una versión recombinante del factor sigma de mantenimiento RpoD y una plantilla de ADN bicatenario generada por PCR. Si bien las técnicas de purificación de proteínas y los enfoques para ensamblar ensayos de transcripción in vitro son conceptualmente bien entendidos y relativamente comunes, las consideraciones de manejo para las ARN polimerasas a menudo difieren de un organismo a otro. El protocolo presentado aquí está diseñado para estudios enzimáticos sobre la ARN polimerasa de B. burgdorferi. El método se puede adaptar para probar el papel de los factores de transcripción, promotores y modificaciones postraduccionales en la actividad de la ARN polimerasa.
Introduction
La enfermedad de Lyme y la fiebre recurrente son causadas por patógenos espiroquetas en los géneros Borrelia y Borreliella 1,2,3. La enfermedad de Lyme es una enfermedad transmitida por vectores prominente en América del Norte y, en consecuencia, Borreliella burgdorferi es un organismo modelo prominente para estudiar la biología de las espiroquetas 4,5. Las investigaciones sobre los mecanismos de regulación transcripcional de B. burgdorferi tienen como objetivo comprender mejor sus adaptaciones a los cambios en el medio ambiente a medida que circula entre su vector garrapata y los huéspedes mamíferos 6,7. Los cambios en el pH, la temperatura, la osmolaridad, la disponibilidad de nutrientes, los ácidos grasos de cadena corta, los ácidos orgánicos y los niveles de oxígeno disuelto y dióxido de carbono modulan la expresión de genes que son importantes para que B. burgdorferi sobreviva en su artrópodo vector e infecte a los animales 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vincular estas respuestas a estímulos con mecanismos reguladores ha sido un aspecto importante de la investigación de B. burgdorferi 19.
Los factores de transcripción y los factores sigma controlan la transcripción de genes que llevan a cabo procesos celulares. Las espiroquetas de Lyme y fiebre recidivante albergan un conjunto relativamente escaso de factores de transcripción y factores sigma alternativos. A pesar de esto, existen cambios transcripcionales complejos que dirigen las respuestas de B. burgdorferi al medio ambiente20,21,22. Los mecanismos específicos que impulsan los cambios transcripcionales en B. burgdorferi en respuesta a los cambios ambientales siguen sin estar claros. Los ensayos de transcripción in vitro son herramientas poderosas para emplear un enfoque bioquímico para evaluar la función y los mecanismos reguladores de los factores de transcripción y los factores sigma23,24,25,26.
Recientemente se estableció un sistema de ensayo de transcripción in vitro utilizando la ARN polimerasa de B. burgdorferi 24. Como las bacterias a menudo tienen fisiologías celulares únicas, las ARN polimerasas de diferentes especies y géneros responden de manera diferente a la purificación enzimática, el almacenamiento de enzimas y las condiciones de amortiguación de reacción27. B. burgdorferi también está genéticamente distante de las muchas especies bacterianas en las que se han estudiado las ARN polimerasas20. Los aspectos de la preparación enzimática como la lisis, el lavado y las condiciones del tampón de elución, el tampón de almacenamiento, el tampón de reacción de transcripción in vitro y el método de construcción del ensayo pueden alterar la actividad de la ARN polimerasa. En este documento, proporcionamos un protocolo para la purificación de la ARN polimerasa y el factor sigma RpoD, la producción de plantillas lineales de ADN bicatenario y la construcción de ensayos de transcripción in vitro para facilitar la reproducibilidad entre laboratorios que utilizan este sistema. Detallamos un ejemplo de reacción para demostrar el rango lineal para la transcripción dependiente de RpoD y discutimos las limitaciones y alternativas a este enfoque.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ensayos de transcripción in vitro construidos utilizando el protocolo presentado se utilizaron recientemente para estudiar el papel de un factor de transcripción en B. burgdorferi y se pueden aplicar para construir experimentos similares utilizando otros factores de transcripción, factores sigma y moléculas23. Una vez obtenida la ARN polimerasa activa de B. burgdorferi y detectada su actividad, se pueden modificar los componentes y las condiciones dentro de los e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Inversión Estratégica en Ciencias de la Salud Faculty Development Grant de la Universidad de Creighton. La cepa RpoC-His10X de B. burgdorferi fue amablemente proporcionada por el Dr. D. Scott Samuels de la Universidad de Montana. La cepa de E. coli que alberga el plásmido pMAL-C5X que codifica un alelo rpoD marcado con proteína de unión a maltosa fue amablemente proporcionada por el Dr. Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
Referenzen
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
