Получение цитоплазматических и ядерных длинных РНК из первичных и культивируемых клеток
Summary
Настоящий протокол предлагает эффективный и гибкий метод выделения РНК из ядерных и цитоплазматических фракций с использованием культивируемых клеток с последующей валидацией с помощью кПЦР. Это эффективно служит заменой другим наборам для подготовки РНК.
Abstract
Разделение внутриклеточных компонентов было ключевым инструментом в клеточной биологии в течение многих лет и могло дать полезную информацию о том, как их расположение может повлиять на их функцию. В частности, разделение ядерной и цитоплазматической РНК стало важным в контексте раковых клеток и поиска новых мишеней для лекарств. Покупка наборов для экстракции ядерно-цитоплазматической РНК может быть дорогостоящей, когда многие из необходимых материалов можно найти в типичных лабораторных условиях. Используя настоящий метод, который может заменить более дорогие наборы или другие трудоемкие процессы, для выделения ядерной и цитоплазматической РНК необходимы только самодельный буфер лизиса, настольная центрифуга и колонки для очистки выделения РНК. Буфер для лизиса используется для мягкого лизиса внешней мембраны клетки, не влияя на целостность ядерной оболочки, что позволяет высвобождать ее внутриклеточные компоненты. Затем ядра могут быть выделены простой стадией центрифугирования, поскольку они обладают более высокой плотностью, чем лизирующий раствор. Центрифугирование используется для разделения этих областей на основе различий в их плотности, чтобы изолировать субклеточные элементы в ядре от элементов цитоплазмы. После того, как центрифугирование изолировало различные компоненты, набор для очистки РНК используется для очистки содержимого РНК, и проводится кПЦР для проверки качества разделения, количественно определяемого количеством ядерной и цитоплазматической РНК в различных фракциях. Были достигнуты статистически значимые уровни разделения, иллюстрирующие эффективность протокола. Кроме того, эта система может быть адаптирована для выделения различных типов РНК (общей, малой РНК и т. д.), что позволяет целенаправленно изучать взаимодействия цитоплазмы и ядра и помогает понять различия в функциях РНК, которые находятся в ядре и цитоплазме.
Introduction
Клеточное фракционирование на субклеточные компоненты позволяет выделять и изучать определенные биохимические домены и помогает определить локализацию конкретных клеточных процессов и то, как это может повлиять на их функцию1. Выделение РНК из различных внутриклеточных локаций может позволить повысить точность генетического и биохимического анализа событий на уровне транскрипции и других взаимодействий между ядром и цитоплазмой, что служит основной целью текущего протокола2. Этот протокол был разработан для обеспечения выделения цитоплазматических и ядерных РНК для определения их соответствующих ролей в ядерном экспорте и понимания того, как субклеточная локализация РНК в ядре и цитоплазме может влиять на их функцию в клеточных процессах. Используя материалы из типичных лабораторных условий, удалось добиться ядерного и цитоплазматического фракционирования более эффективно и с меньшими затратами, чем ранее установленные протоколы, не ставя под угрозу качество результатов3.
Кроме того, обмен молекулами между цитоплазмой и ядром можно изучать непосредственно путем разделения этих областей. В частности, понимание транскриптома имеет важное значение для понимания развития и болезни. Однако РНК могут находиться на разных уровнях созревания в любой момент времени и могут усложнить последующий анализ. Этот протокол позволяет изолировать РНК из ядерных и цитоплазматических субклеточных фракций, что может помочь в исследованиях РНК и позволить лучше понять конкретную интересующую РНК, например, локализацию некодирующих РНК или анализ сплайс-соединений в ядре.
Этот протокол был оптимизирован для выделения цитоплазматических и ядерных длинных РНК, включая мРНК, рРНК и длинные некодирующие РНК (днРНК), из-за селективности по размеру используемой колонки очистки РНК, которая может быть модифицирована для выделения других интересующих РНК. Ранее функция длинных РНК, таких как мРНК и днРНК, сильно зависела от их соответствующей локализации в клетке 4,5. Таким образом, изучение экспорта из ядра в субклеточные домены стало более направленным на понимание роли, которую экспорт РНК или других клеточных компонентов может играть в клетке. днРНК служат ярким примером этого, поскольку их трансляция и последующие эффекты в значительной степени зависят от близости и взаимодействия с другими формами РНК6. Кроме того, обмен клеточными элементами между ядерными и цитоплазматическими областями связан с механизмами резистентности к различным методам лечения рака7. Выделение внутриклеточных компартментов позволило разработать ингибиторы ядерного экспорта, что уменьшило эффекты механизмов резистентности к различным методам лечения8.
После разделения ядерной и цитоплазматической РНК выполняются этапы очистки интересующей РНК. Поскольку наборы для очистки РНК обычно встречаются в лабораториях и функционируют для очистки и выделения длинных РНК, они хорошо служат целям этого протокола. Для очистки РНК создание соотношения 260:280 более 1,8 имеет решающее значение для обеспечения качества образцов для секвенирования РНК или других подобных процедур, требующих высокого уровня чистоты и выделения. Нерегулярные значения 260:280 указывают на загрязнение фенолом, демонстрируя плохую изоляцию и давая неточные результаты9.
После завершения очистки РНК и подтверждения того, что значения 260:280 превышают допустимый диапазон, для проверки результатов выделения ядерной и цитоплазматической фракций использовали кПЦР. При этом были использованы праймеры, специфичные для интересующей области, для демонстрации уровней ядерного и цитоплазматического фракционирования. В этом протоколе MALAT1 и TUG1 использовались в качестве ядерных и цитоплазматических маркеров соответственно10. Вместе они позволяют продемонстрировать высокие уровни ядерного фракционирования с MALAT1, в то время как цитоплазматическое фракционирование, как ожидается, будет низким. И наоборот, при использовании TUG1 ожидается, что уровни цитоплазматического фракционирования будут выше, чем уровни ядерного фракционирования.
Используя этот протокол, можно было выделить РНК на основе их положения действия в клетке. Из-за широкого доступа ко многим материалам и использования только лизисного буфера и методов центрифугирования на основе плотности во время этого эксперимента широко распространена применимость к другим типам РНК и другим клеточным компонентам. Это может предоставить важную информацию, проливая свет на события выражения, зависящие от местоположения, которые в противном случае были бы неразличимы без разделения.
Protocol
Representative Results
Discussion
На протяжении всего протокола были предприняты некоторые шаги для оптимизации элементов, чтобы они были наиболее эффективными для интересующей клеточной линии. Хотя шаги в рамках протокола относительно просты, может потребоваться анализ и незначительные корректировки в критических …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается грантами Американского общества гематологов, Фонда Роберта Вуда Джонсона, Благотворительного фонда Дорис Дьюк, Фонда Эдварда. Эванса и Национального института рака (1K08CA230319).
Materials
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
Referenzen
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. RNA localization in development. Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. . Bacterial Cell Wall. , (1994).
- Fersht, A. . Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, 233 (2018).
