Procesamiento automático de imágenes para determinar la estructura del tamaño de la comunidad de macroinvertebrados ribereños
Summary
El artículo se basa en la creación de un protocolo adaptado para escanear, detectar, clasificar e identificar objetos digitalizados correspondientes a macroinvertebrados bentónicos de río utilizando un procedimiento de imagen semiautomático. Este procedimiento permite la adquisición de las distribuciones de tamaño individuales y métricas de tamaño de una comunidad de macroinvertebrados en aproximadamente 1 h.
Abstract
El tamaño corporal es un rasgo funcional importante que puede utilizarse como bioindicador para evaluar los impactos de las perturbaciones en las comunidades naturales. La estructura del tamaño de la comunidad responde a gradientes bióticos y abióticos, incluidas las perturbaciones antropogénicas en taxones y ecosistemas. Sin embargo, la medición manual de organismos de cuerpo pequeño como los macroinvertebrados bentónicos (por ejemplo, >500 μm a unos pocos centímetros de largo) lleva mucho tiempo. Para acelerar la estimación de la estructura del tamaño de la comunidad, aquí, desarrollamos un protocolo para medir semiautomáticamente el tamaño corporal individual de los macroinvertebrados de río preservados, que son uno de los bioindicadores más utilizados para evaluar el estado ecológico de los ecosistemas de agua dulce. Este protocolo está adaptado de una metodología existente desarrollada para escanear mesozooplancton marino con un sistema de escaneo diseñado para muestras de agua. El protocolo consta de tres pasos principales: (1) escanear submuestras (fracciones de tamaño de muestra finas y gruesas) de macroinvertebrados de río y procesar las imágenes digitalizadas para individualizar cada objeto detectado en cada imagen; (2) crear, evaluar y validar un conjunto de aprendizaje a través de inteligencia artificial para separar semiautomáticamente las imágenes individuales de macroinvertebrados de los detritos y artefactos en las muestras escaneadas; y (3) que representa la estructura de tamaño de las comunidades de macroinvertebrados. Además del protocolo, este trabajo incluye los resultados de calibración y enumera varios desafíos y recomendaciones para adaptar el procedimiento a las muestras de macroinvertebrados y considerar mejoras adicionales. En general, los resultados apoyan el uso del sistema de escaneo presentado para la medición automática del tamaño corporal de los macroinvertebrados de río y sugieren que la representación de su espectro de tamaño es una herramienta valiosa para la bioevaluación rápida de los ecosistemas de agua dulce.
Introduction
Los macroinvertebrados bentónicos se utilizan ampliamente como bioindicadores para determinar el estado ecológico de las masas de agua1. La mayoría de los índices para describir comunidades de macroinvertebrados se centran en métricas taxonómicas. Sin embargo, se fomentan nuevas herramientas de bioevaluación que integren el tamaño corporal para proporcionar una perspectiva alternativa o complementaria a los enfoques taxonómicos 2,3.
El tamaño corporal se considera un metarasgo que está relacionado con otros rasgos vitales como el metabolismo, el crecimiento, la respiración y el movimiento4. Además, el tamaño corporal puede determinar la posición trófica y las interacciones5. La relación entre el tamaño corporal individual y la biomasa normalizada (o abundancia) por clase de tamaño en una comunidad se define como el espectro de tamaño6 y sigue el patrón general de una disminución lineal en la biomasa normalizada a medida que aumenta el tamaño individual en una escala logarítmica7. La pendiente de esta relación lineal ha sido ampliamente estudiada teóricamente, y estudios empíricos a través de ecosistemas la han utilizado como un indicador ecológico de la estructura del tamaño de la comunidad4. Otro indicador sintético de la estructura del tamaño de la comunidad que se ha utilizado con éxito en los estudios de funcionamiento de la diversidad de la diversidad del tamaño de la comunidad, que se representa como el índice de Shannon de las clases de tamaño del espectro de tamaño o su análogo, que se calcula sobre la base de las distribuciones de tamaño individuales8.
En los ecosistemas de agua dulce, la estructura de tamaño de diferentes grupos faunísticos se utiliza como indicador atáxico para evaluar la respuesta de las comunidades bióticas a gradientes ambientales 9,10,11 y a perturbaciones antropogénicas 12,13,14,15,16. Los macroinvertebrados no son una excepción, y su estructura de tamaño también responde a cambios ambientales17,18 y perturbaciones antropogénicas, como la minería 19, el uso de la tierra 20, o el enriquecimiento de nitrógeno (N) y fósforo (P) 20,21,22. Sin embargo, medir a cientos de individuos para describir la estructura del tamaño de la comunidad es una tarea tediosa y lenta que a menudo se evita como una medición de rutina en los laboratorios debido a la falta de tiempo. Así, se han desarrollado varios métodos de imagen semiautomáticos o automáticos para clasificar y medir especímenes23,24,25,26. Sin embargo, la mayoría de estos métodos se centran en la clasificación taxonómica más que en el tamaño individual de los organismos y no están listos para su uso para todo tipo de macroinvertebrados. En ecología del plancton marino, un sistema de análisis de imágenes de barrido se ha utilizado ampliamente para determinar el tamaño y la composición taxonómica de las comunidades de zooplancton 27,28,29,30,31. Este instrumento se puede encontrar en varios institutos marinos de todo el mundo, y se utiliza para escanear muestras de zooplancton preservadas para obtener imágenes digitales de alta resolución de toda la muestra. El presente protocolo adapta el uso de este instrumento para estimar el espectro del tamaño de la comunidad de macroinvertebrados en los ríos de manera rápida y automática sin invertir en la creación de un nuevo dispositivo.
El protocolo consiste en escanear una muestra y procesar toda la imagen para obtener automáticamente imágenes individuales (es decir, viñetas) de los objetos de la muestra. Varias medidas de forma, tamaño y características de nivel de gris caracterizan cada objeto y permiten la clasificación automática de los objetos en categorías, que luego son validadas por un experto. El tamaño individual de cada organismo se calcula utilizando el biovolumen elipsoidal (mm3), que se deriva del área del organismo medida en píxeles. Esto permite obtener el espectro de tamaño de la muestra de manera rápida. Hasta donde sabemos, este sistema de imágenes de escaneo solo se ha utilizado para procesar muestras de mesozooplancton, pero el dispositivo puede permitir trabajar con macroinvertebrados bentónicos de agua dulce.
El objetivo general de este estudio es, por lo tanto, introducir un método para obtener rápidamente el tamaño individual de los macroinvertebrados de río preservados mediante la adaptación de un protocolo existente previamente utilizado con mesozooplancton marino 27,32,33. El procedimiento consiste en utilizar un enfoque semiautomático que opera con un dispositivo de escaneo para escanear muestras de agua y tres software abierto para procesar las imágenes escaneadas. Aquí se presenta un protocolo adaptado para escanear, detectar e identificar macroinvertebrados de río digitalizados para adquirir automáticamente la estructura de tamaño de la comunidad y las métricas de tamaño relacionadas. La evaluación del procedimiento y las directrices para mejorar la eficiencia también se presentan a partir de 42 imágenes escaneadas de muestras de macroinvertebrados fluviales recogidas en tres cuencas del noreste (NE) de la Península Ibérica (Ter, Segre-Ebre y Besòs).
Las muestras se recogieron en tramos fluviales de 100 m siguiendo el protocolo de muestreo de campo y análisis de laboratorio de macroinvertebrados bentónicos de río en ríos vadeables del Gobierno español34. Las muestras se recolectaron con un muestreador surber (marco: 0,3 m x 0,3 m, malla: 250 μm) después de un estudio de múltiples hábitats. En el laboratorio, las muestras se limpiaron y tamizaron a través de una malla de 5 mm y una malla de 500 μm para obtener dos submuestras: una submuestra gruesa (malla de 5 mm) y una submuestra fina (malla de 500 μm), que se almacenaron en viales separados y se conservaron en etanol al 70%. Separar la muestra en dos fracciones de tamaño permite una mejor estimación de la estructura del tamaño de la comunidad, ya que los organismos grandes son más raros y menos que los organismos pequeños. De lo contrario, la muestra escaneada tiene una representación sesgada de la fracción de gran tamaño.
Protocol
Representative Results
Discussion
La adaptación de la metodología descrita por Gorsky et al. 2010 para macroinvertebrados ribereños permite una alta precisión de clasificación en la estimación de la estructura del tamaño de la comunidad en macroinvertebrados de agua dulce. Los resultados sugieren que el protocolo puede reducir el tiempo para estimar la estructura de tamaño individual en una muestra a aproximadamente 1 hora. Por lo tanto, el protocolo propuesto está destinado a promover el uso rutinario de espectros de tamaño de macroinvertebrad…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha contado con el apoyo del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (número de subvención RTI2018-095363-B-I00). Agradecemos a los miembros del CERM-UVic-UCC Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach y Núria Sellarès su trabajo en muestreo de campo de macroinvertebrados y clasificación de laboratorio y a David Albesa por colaborar en el escaneo de muestras. Por último, agradecemos a Josep Maria Gili y al Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) el uso de las instalaciones del laboratorio y del dispositivo escáner.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
Referenzen
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe’s surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography – Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l., Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l., Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M., Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. , (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- . Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013)
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013)
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
