Elaborazione automatica delle immagini per determinare la struttura delle dimensioni della comunità dei macroinvertebrati fluviali
Summary
L’articolo si basa sulla creazione di un protocollo adattato per scansionare, rilevare, ordinare e identificare oggetti digitalizzati corrispondenti a macroinvertebrati fluviali bentonici utilizzando una procedura di imaging semiautomatica. Questa procedura consente l’acquisizione delle distribuzioni dimensionali individuali e delle metriche dimensionali di una comunità di macroinvertebrati in circa 1 ora.
Abstract
La dimensione corporea è un importante tratto funzionale che può essere utilizzato come bioindicatore per valutare gli impatti delle perturbazioni nelle comunità naturali. La struttura delle dimensioni della comunità risponde ai gradienti biotici e abiotici, comprese le perturbazioni antropogeniche tra taxa ed ecosistemi. Tuttavia, la misurazione manuale di organismi di piccole dimensioni come i macroinvertebrati bentonici (ad esempio, >da 500 μm a pochi centimetri di lunghezza) richiede molto tempo. Per accelerare la stima della struttura delle dimensioni della comunità, qui, abbiamo sviluppato un protocollo per misurare semi-automaticamente le dimensioni corporee individuali dei macroinvertebrati fluviali conservati, che sono uno dei bioindicatori più comunemente usati per valutare lo stato ecologico degli ecosistemi di acqua dolce. Questo protocollo è adattato da una metodologia esistente sviluppata per scansionare il mesozooplancton marino con un sistema di scansione progettato per campioni d’acqua. Il protocollo consiste in tre fasi principali: (1) scansione di sottocampioni (frazioni di dimensioni del campione fini e grossolane) di macroinvertebrati fluviali ed elaborazione delle immagini digitalizzate per individualizzare ogni oggetto rilevato in ciascuna immagine; (2) creare, valutare e convalidare un set di apprendimento attraverso l’intelligenza artificiale per separare semi-automaticamente le singole immagini di macroinvertebrati da detriti e artefatti nei campioni scansionati; e (3) raffigurando la struttura dimensionale delle comunità di macroinvertebrati. Oltre al protocollo, questo lavoro include i risultati della calibrazione ed elenca diverse sfide e raccomandazioni per adattare la procedura ai campioni di macroinvertebrati e da considerare per ulteriori miglioramenti. Nel complesso, i risultati supportano l’uso del sistema di scansione presentato per la misurazione automatica delle dimensioni corporee dei macroinvertebrati fluviali e suggeriscono che la rappresentazione del loro spettro dimensionale è uno strumento prezioso per la rapida biovalutazione degli ecosistemi di acqua dolce.
Introduction
I macroinvertebrati bentonici sono ampiamente utilizzati come bioindicatori per determinare lo stato ecologico dei corpi idrici1. La maggior parte degli indici per descrivere le comunità di macroinvertebrati si concentra su metriche tassonomiche. Tuttavia, i nuovi strumenti di biovalutazione che integrano le dimensioni corporee sono incoraggiati a fornire una prospettiva alternativa o complementare agli approcci tassonomici 2,3.
La dimensione del corpo è considerata un metatratto correlato ad altri tratti vitali come il metabolismo, la crescita, la respirazione e il movimento4. Inoltre, le dimensioni del corpo possono determinare la posizione trofica e le interazioni5. La relazione tra le dimensioni corporee individuali e la biomassa normalizzata (o abbondanza) per classe dimensionale in una comunità è definita come lo spettro dimensionale6 e segue il modello generale di una diminuzione lineare della biomassa normalizzata all’aumentare delle dimensioni individuali su una scala logaritmica7. La pendenza di questa relazione lineare è stata ampiamente studiata teoricamente e studi empirici attraverso gli ecosistemi l’hanno utilizzata come indicatore ecologico della struttura dimensionale della comunità4. Un altro indicatore sintetico della struttura dimensionale della comunità che è stato utilizzato con successo negli studi sul funzionamento della biodiversità-ecosistema è la diversità delle dimensioni della comunità, che è rappresentata come l’indice di Shannon delle classi dimensionali dello spettro dimensionale o il suo analogo, che viene calcolato in base alle distribuzioni dimensionali individuali8.
Negli ecosistemi di acqua dolce, la struttura dimensionale di diversi gruppi faunistici viene utilizzata come indicatore atassico per valutare la risposta delle comunità biotiche ai gradienti ambientali 9,10,11 e alle perturbazioni antropogeniche 12,13,14,15,16. I macroinvertebrati non fanno eccezione, e la loro struttura dimensionale risponde anche ai cambiamenti ambientali17,18 e alle perturbazioni antropogeniche, come l’estrazione mineraria 19, l’uso del suolo 20, o l’arricchimento di azoto (N) e fosforo (P)20,21,22. Tuttavia, misurare centinaia di individui per descrivere la struttura delle dimensioni della comunità è un compito noioso e dispendioso in termini di tempo che viene spesso evitato come misurazione di routine nei laboratori a causa della mancanza di tempo. Pertanto, sono stati sviluppati diversi metodi di imaging semiautomatici o automatici per classificare e misurare i campioni23,24,25,26. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono focalizzati sulla classificazione tassonomica più che sulla dimensione individuale degli organismi e non sono pronti per l’uso per tutti i tipi di macroinvertebrati. Nell’ecologia del plancton marino, un sistema di analisi delle immagini a scansione è stato ampiamente utilizzato per determinare le dimensioni e la composizione tassonomica delle comunità di zooplancton 27,28,29,30,31. Questo strumento può essere trovato in diversi istituti marini in tutto il mondo e viene utilizzato per scansionare campioni di zooplancton conservati per ottenere immagini digitali ad alta risoluzione dell’intero campione. Il presente protocollo adatta l’uso di questo strumento per stimare lo spettro dimensionale della comunità di macroinvertebrati nei fiumi in modo rapido e automatico senza investire nella creazione di un nuovo dispositivo.
Il protocollo consiste nella scansione di un campione e nell’elaborazione dell’intera immagine per ottenere automaticamente singole immagini (cioè vignette) degli oggetti nel campione. Diverse misure di forma, dimensioni e caratteristiche di livello di grigio caratterizzano ogni oggetto e consentono la classificazione automatica degli oggetti in categorie, che vengono poi convalidate da un esperto. La dimensione individuale di ciascun organismo viene calcolata utilizzando il biovolume ellissoidale (mm3), che deriva dall’area dell’organismo misurata in pixel. Ciò consente di ottenere rapidamente lo spettro dimensionale del campione. Per quanto ne sappiamo, questo sistema di imaging a scansione è stato utilizzato solo per elaborare campioni di mesozooplancton, ma il dispositivo potrebbe potenzialmente consentire di lavorare con macroinvertebrati bentonici d’acqua dolce.
L’obiettivo generale di questo studio è, quindi, quello di introdurre un metodo per ottenere rapidamente la dimensione individuale dei macroinvertebrati fluviali conservati adattando un protocollo esistente precedentemente utilizzato con mesozooplancton marino 27,32,33. La procedura consiste nell’utilizzare un approccio semi-automatico che opera con un dispositivo di scansione per scansionare campioni d’acqua e tre software aperti per elaborare le immagini scansionate. Viene qui presentato un protocollo adattato per scansionare, rilevare e identificare i macroinvertebrati fluviali digitalizzati per acquisire automaticamente la struttura delle dimensioni della comunità e le relative metriche dimensionali. La valutazione della procedura e le linee guida per migliorare l’efficienza sono presentate anche sulla base di 42 immagini scansionate di campioni di macroinvertebrati fluviali raccolti da tre bacini nella penisola iberica nord-orientale (NE) (Ter, Segre-Ebre e Besòs).
I campioni sono stati raccolti in tratti fluviali di 100 m seguendo il protocollo per il campionamento sul campo e l’analisi di laboratorio di macroinvertebrati fluviali bentonici in fiumi guadabili dal governo spagnolo34. I campioni sono stati raccolti con un campionatore surber (telaio: 0,3 m x 0,3 m, maglia: 250 μm) a seguito di un’indagine multi-habitat. In laboratorio, i campioni sono stati puliti e setacciati attraverso una maglia di 5 mm e una maglia di 500 μm per ottenere due sottocampioni: un sottocampione grossolano (maglia da 5 mm) e un sottocampione fine (maglia da 500 μm), che sono stati conservati in fiale separate e conservati in etanolo al 70%. La separazione del campione in due frazioni dimensionali consente una migliore stima della struttura dimensionale della comunità, poiché gli organismi di grandi dimensioni sono più rari e meno degli organismi piccoli. In caso contrario, il campione scansionato ha una rappresentazione distorta della frazione di grandi dimensioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’adattamento della metodologia descritta da Gorsky et al. 2010 per i macroinvertebrati fluviali consente un’elevata accuratezza di classificazione nella stima della struttura dimensionale della comunità nei macroinvertebrati d’acqua dolce. I risultati suggeriscono che il protocollo può ridurre il tempo per stimare la struttura dimensionale individuale in un campione a circa 1 ora. Pertanto, il protocollo proposto ha lo scopo di promuovere l’uso di routine degli spettri dimensionali dei macroinvertebrati come bioindica…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero spagnolo della Scienza, dell’Innovazione e dell’Università (numero di sovvenzione RTI2018-095363-B-I00). Ringraziamo i membri del CERM-UVic-UCC Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach e Núria Sellarès per il loro lavoro nel campionamento dei campi di macroinvertebrati e nella selezione di laboratorio e David Albesa per aver collaborato alla scansione dei campioni. Ringraziamo infine Josep Maria Gili e l’Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) per l’uso delle strutture di laboratorio e del dispositivo di scansione.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
Referenzen
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe’s surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography – Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l., Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l., Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M., Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. , (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- . Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013)
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013)
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
