Summary
تصف هذه الورقة استخدام جهاز تصوير بصري جديد وسريع لتصوير عمر التلألؤ الضوئي العياني للعينات الباعثة للاضمحلال الطويل. يتم وصف إجراءات التكامل والحصول على الصور والتحليل ، جنبا إلى جنب مع إعداد وتوصيف مواد الاستشعار للتصوير وتطبيق التصوير في دراسة العينات البيولوجية.
Abstract
تقدم هذه الورقة جهاز تصوير جديد لمدى الحياة للتلألؤ الضوئي مصمم لرسم خريطة لتركيز الأكسجين الجزيئي (O 2) في عينات فسفورية مختلفة تتراوح من الطلاءات الصلبة الحساسة ل O 2 إلى عينات الأنسجة الحيوانية الحية الملطخة بمجسات حساسة O2 قابلة للذوبان. على وجه الخصوص ، تم استخدام مسبار الأشعة تحت الحمراء القريبة من الجسيمات النانوية NanO2-IR ، والذي يمكن استثارته باستخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء 625 نانومتر (LED) وينبعث عند 760 نانومتر. يعتمد نظام التصوير على كاميرا Timepix3 (Tpx3Cam) والمحول البصري الميكانيكي ، والذي يضم أيضا مكثفا للصورة. O2 الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للفسفور (PLIM) مطلوب بشكل شائع للدراسات المختلفة ، لكن المنصات الحالية لها قيود في دقتها ومرونتها العامة وسهولة استخدامها.
النظام المعروض هنا عبارة عن جهاز تصوير سريع وحساس للغاية ، وهو مبني على مستشعر بصري مدمج ووحدة رقاقة قراءة ، Tpx3Cam. يظهر أنه ينتج إشارات فسفرة عالية الكثافة وقيم عمر مستقرة من عينات الأنسجة المعوية الملطخة بالسطح أو الشظايا الملطخة داخل الأمعاء الغليظة ويسمح برسم خرائط مفصلة لمستويات الأنسجة O2 في حوالي 20 ثانية أو أقل. كما يتم تقديم التجارب الأولية على تصوير نقص الأكسجة في الأورام المطعمة في الحيوانات اللاواعية. نصف أيضا كيف يمكن إعادة تكوين جهاز التصوير للاستخدام مع المواد الحساسة O2 بناء على أصباغ Pt-porphyrin باستخدام مصباح LED 390 نانومتر للإثارة ومرشح تمرير النطاق 650 نانومتر للانبعاثات. بشكل عام ، وجد أن جهاز التصوير PLIM ينتج قياسات كمية دقيقة لقيم العمر للمجسات المستخدمة والخرائط ثنائية الأبعاد ذات الصلة لتركيز O2 . كما أنه مفيد للتصوير الأيضي لنماذج الأنسجة خارج الجسم الحي والحيوانات الحية.
Introduction
O 2 هو أحد المعلمات البيئية الرئيسية للأنظمة الحية ، ومعرفة توزيع O 2 وديناميكياته مهمة للعديد من الدراسات البيولوجية1،2،3. يكتسب تقييم أكسجة الأنسجة عن طريق المجسات الفسفورية4،5،6،7،8 و PLIM 9،10،11،12،13 شعبية في البحوث البيولوجية والطبية3،9،14،15،16 ، 17,18,19. وذلك لأن PLIM ، على عكس قياسات شدة التألق أو الفسفرة ، لا يتأثر بالعوامل الخارجية مثل تركيز المسبار ، والتبييض الضوئي ، وشدة الإثارة ، والمحاذاة البصرية ، والتشتت ، والتألق الذاتي.
ومع ذلك ، فإن منصات O2 PLIM الحالية محدودة بحساسيتها وسرعة التقاط الصور ودقتها وقابليتها للاستخدام بشكل عام. كثيرا ما يستخدم عد الفوتون المفرد المرتبط بالوقت (TCSPC) ، جنبا إلى جنب مع إجراء المسح النقطي ، في أجهزة PLIM والتصوير المجهري مدى الحياة (FLIM)20،21،22. ومع ذلك ، نظرا لأن PLIM يتطلب وقتا طويلا لبقاء البكسل (في نطاق ميلي ثانية) ، فإن وقت الحصول على الصور أطول بكثير مما هو مطلوب لتطبيقات FLIM20،22،23. تقنيات أخرى ، مثل كاميرات CCD / CMOS ذات البوابات ، تفتقر إلى حساسية الفوتون الفردي ولها معدلات إطارات منخفضة20،24،25،26. علاوة على ذلك ، تستخدم أنظمة PLIM الحالية في الغالب في الشكل المجهري ، في حين أن الأنظمة العيانية أقل شيوعا27.
تم إعداد جهاز تصوير الماكروPLIM 28 المستند إلى TCSPC للتغلب على العديد من هذه القيود. تم تسهيل تصميم جهاز التصوير إلى حد كبير من خلال استخدام محول ميكانيكي بصري جديد ، Cricket ، والذي يحتوي على ما يلي: ط) محولان C-mount ، يوفران سهولة اقتران وحدة الكاميرا على الجانب الخلفي والعدسة الموضوعية على الجانب الأمامي ؛ ب) مبيت داخلي لمكثف الصورة ومقبس طاقة للأخير على الجانب الخارجي من لعبة الكريكيت ؛ iii) مساحة داخلية خلف محول C-mount الأمامي حيث يمكن وضع مرشح انبعاث قياسي 25 مم أمام المكثف ؛ و iv) بصريات موازية للضوء مدمجة مع منظمات حلقية ، والتي تسمح بالمحاذاة / التركيز البصري بين العدسة والكاميرا لإنتاج صور واضحة على شريحة الكاميرا.
في جهاز التصوير المجمع ، تقترن وحدة الكاميرا بالجانب الخلفي من محول الكريكيت ، والذي يضم أيضا مكثفا للصورة يتكون من كاثود ضوئي متبوعا بلوحة قناة دقيقة (MCP) ، ومكبر للصوت ، وميض سريع ، فوسفور P47. تم تركيب مرشح انبعاث 760 نانومتر ± 50 نانومتر داخل لعبة الكريكيت ، وعدسة موضوعية ، NMV-50M11 '' ، متصلة بمحول C-mount الأمامي الجانبي. أخيرا ، يتم محاذاة العدسة والكاميرا بصريا مع منظمات الحلقة.
يتمثل دور المكثف في اكتشاف الفوتونات الواردة وتحويلها إلى رشقات نارية سريعة من الضوء على شريحة الكاميرا ، والتي يتم تسجيلها واستخدامها لتوليد اضمحلال الانبعاثات والصور مدى الحياة. تشتمل وحدة الكاميرا على مجموعة مستشعرات بصرية متقدمة قائمة على TCSPC (256 بكسل × 256 بكسل) وشريحة قراءة من الجيل الجديد29،30،31،32،33 ، والتي تسمح بالتسجيل المتزامن لوقت الوصول (TOA) والوقت فوق عتبة (TOT) من رشقات الفوتون في كل بكسل من رقاقة التصوير بدقة زمنية تبلغ 1.6 نانوثانية ومعدل قراءة 80 ميجابكسل / ثانية.
في هذا التكوين ، تتميز الكاميرا المزودة بالمكثف بحساسية فوتون واحد. إنه يعتمد على البيانات ويستند إلى نظام قراءة كاشف البكسل السريع (SPIDR)34. تميزت الدقة المكانية للتصوير سابقا بمستشعرات O2 الفسفورية المستوية وقناع لوحة الدقة. تم قياس وظيفة استجابة الجهاز (IRF) عن طريق تصوير مستشعر الفلورسنت المستوي تحت نفس الإعدادات المستخدمة في جميع القياسات الأخرى. كان عمر الصبغة البالغ حوالي 2.6 نانوثانية قصيرا بما يكفي لاستخدامه لقياس IRF في وضع PLIM. يمكن للتصوير تصوير كائنات يصل حجمها إلى 18 مم × 18 مم بدقة مكانية وزمانية تبلغ 39.4 ميكرومتر و 30.6 نانوثانية (العرض الكامل بنصف الحد الأقصى) ،على التوالي 28.
تصف البروتوكولات التالية تجميع جهاز تصوير الماكرو واستخدامه اللاحق لرسم خرائط تركيز O 2 في العينات البيولوجية الملطخة بمسبار O2 القريب من الأشعة تحت الحمراء ، NanO2-IR35. المسبار عبارة عن مسبار O2 ساطع وقابل للضوء ومنفذ للخلايا يعتمد على صبغة البلاتين (II) البنزوبورفيرين (PtBP). إنه مثير عند 625 نانومتر ، وينبعث عند 760 نانومتر ، ويوفر استجابة بصرية قوية ل O 2 في النطاق الفسيولوجي (0٪ -21٪ أو 0-210 ميكرومتر من O2). كما تم عرض جهاز التصوير لتوصيف مواد الاستشعار المختلفة بناء على أصباغ البورفيرين Pt (II). بشكل عام ، يكون جهاز التصوير مضغوطا ومرنا ، على غرار كاميرا التصوير الفوتوغرافي الشائعة. في الإعداد الحالي ، يكون جهاز التصوير مناسبا لتطبيقات PLIM واسعة المجال المختلفة. سيؤدي استبدال LED بمصدر ليزر سريع إلى زيادة تحسين أداء جهاز التصوير ويمكن أن يؤدي إلى تمكين تطبيقات FLIM نانوثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات مع الحيوانات بموجب تراخيص صادرة عن هيئة تنظيم المنتجات الصحية (HPRA ، أيرلندا) وفقا لتوجيه مجلس المجتمعات الأوروبية (2010/63 / EU) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في كلية كورك الجامعية.
1. إعداد العينة
- تلطيخ مع التحقيق من عينات الأنسجة الحية خارج الجسم الحي
- للتطبيقات خارج الجسم الحي ، استخدم عينات الأنسجة المعزولة حديثا من إناث الفئران Balb / c البالغة من العمر 4 أسابيع.
- في يوم التجربة ، القتل الرحيم للفأر عن طريق قطع الرأس ، وتشريح شظايا القولون (الأمعاء الغليظة) بسرعة ، بحجم 10 مم تقريبا. اغسلها على الفور باستخدام محلول PBS ، وضعها في وسط DMEM مع استكمال 10 mM Hepes buffer (درجة الحموضة 7.2) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية36.
- للتلطيخ السطحي للجانب المصلي من الأمعاء ، انقل عينات الأنسجة الحية إلى طبق صغير ، ضع 2 مل من DMEM الكامل الذي يحتوي على مسبار NanO2-IR 1 مجم / مل لتغطية عينات الأنسجة ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تبقى الخلايا في أنسجة ما بعد الوفاة حية لعدة ساعات في الثقافة. يظهر NaNO2-IR سمية خلوية طفيفة ، لذلك تم الانتهاء من جميع التجارب في غضون 4 ساعات بعد عزل الأنسجة. - لتلطيخ الأنسجة العميقة داخل الجسم الحي ، انقل قطع الأمعاء إلى طبق بتري جاف ، وقم بإزالة أي DMEM زائد باستخدام ورق الترشيح.
- حقن 1 ميكرولتر من DMEM يحتوي على 1 ملغ / مل NanO2-IR 35 في التجويف باستخدام حقنة هاملتون ، واحتضان العينات لمدة15 دقيقة أو لمدة تصل إلى 4 ساعات.
ملاحظة: يظهر NaNO2-IR تأثيرات سامة للخلايا طفيفة على المدى الطويل ؛ لذلك ، يجب إكمال جميع التجارب في غضون 4 ساعات بعد عزل الأنسجة.
- تحضير أنسجة الورم الملطخة في الحيوانات الحية
- بالنسبة للتطبيقات في الجسم الحي ، خلايا CT26 قبل الصبغة لمدة 18 ساعة في وسط خال من المصل يحتوي على مسبار NaNO2-IR عند 0.05 مجم / مل.
- خذ الماوس ، احلق منطقة الحقن في الجهة اليمنى ، واحقن بحقنة 200 ميكرولتر من خليط من 1 × 10 5 خلايا غير ملطخة و 1 × 105 خلايا ملطخة مسبقا ب NanO2-IR .
- السماح للأورام بالنمو في الفئران ، ومراقبة حجم الورم باستخدام الفرجار ووزن الحيوان بشكل دوري37. تصبح الحيوانات المصابة بأورام مطعمة جاهزة للتصوير في اليوم السابع من نمو الورم.
ملاحظة: تم حساب حجم الورم باستخدام المعادلة (1):
V = (L × W 2) / 2 (1)
حيث L هو قطر الورم ، و W is القطر عمودي على القطر L. - التضحية بالحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم قبل التصوير مباشرة.
2. إعداد التصوير PLIM
- خذ محول الكريكيت ، وقم بإزالة محول C-mount الخلفي للوصول إلى غلاف المكثف بالداخل. أدخل مكثف الصور MCP-125 في هذه الحجرة ، ثم أعد محول C-mount.
- قم بإزالة محول C-mount الأمامي للكريكيت ، وأدخل مرشح الانبعاثات 760 نانومتر ± 50 نانومتر ، وقم بإصلاحه عن طريق إعادة C-mount.
- قم بتوصيل وحدة الكاميرا Tpx3Cam بالجانب الخلفي من وحدة الكريكيت عبر محول C-mount الخاص بها
- قم بتوصيل العدسة بالجانب الأمامي من وحدة الكريكيت عبر محول C-mount الخاص بها.
- قم بتركيب مجموعة الكاميرا بالكامل أعلى الصندوق الأسود البصري ، متجها لأسفل إلى المرحلة التي سيتم تصوير العينات عليها (الشكل 1).
- قم بتركيب مصباح LED فائق السطوع 624 نانومتر على عمود متصل بلوح تجارب داخل الصندوق الأسود.
- قم بتوصيل مؤشر LED بمصدر طاقة ومولد نبض. قم بتشغيل LED ، وركزه لضمان إثارة فعالة وموحدة للعينات المصورة.
- قم بتوصيل الكاميرا بمولد نبضات آخر ، وقم بمزامنة النبضات المرسلة إلى الكاميرا ومؤشر LED38.
- باستخدام الكبل والمقبس الخاصين على وحدة الكريكيت ، قم بتوصيل المكثف بمصدر طاقة قياسي ، واضبط الكسب على 2.7 فولت.
- باستخدام إمكانات التركيز البؤري للعدسة ومحول الكريكيت ، ركز بصريات الكاميرا على مرحلة العينة لإنشاء صور واضحة للعينات ذات تباين وسطوع جيدين.
- لاستخدام جهاز التصوير مع أصباغ Pt-porphyrin ، استبدل 625 نانومتر LED بمصباح LED 390 نانومتر للإثارة ، واستبدل مرشح 760 نانومتر ± 50 نانومتر بمرشح 650 نانومتر ± 50 نانومتر في وحدة الكريكيت.
3. الحصول على الصور
- ضع العينة أمام عدسة الكاميرا.
ملاحظة: استخدم مرحلة قابلة للتعديل x-y-z كحامل للعينة لضبط موضع العينة للحصول على تركيز جيد. - أطفئ جميع الأنوار في الغرفة.
- قم بتشغيل برنامج Sophy لضبط المعلمات التشغيلية ، مثل التركيز ومحاذاة العينة.
ملاحظة: يتم توفير برنامج Sophy مع الكاميرا لإعداد معلمات التصوير وتسجيل البيانات. تأكد من توصيل البرنامج بالكاميرا عن طريق التحقق من رمز الكاميرا. ومع ذلك ، استخدمنا برنامجا مختلفا للحصول على البيانات. - في الوحدات النمطية، حدد إطارات لا نهائية، واضبط وضع تشغيل البيكسل على الوقت فوق الحد.
- في الوحدات النمطية، انتقل إلى معاينة، وحدد الوحدة النشطة. يؤدي هذا إلى فتح نافذة إطارات Medpix / Timpix .
- في هذه النافذة ، قم بتغيير مقياس الألوان ، وقم بتدوير الصورة إلى الاتجاه المطلوب.
- قم بتشغيل المكثف ، وابدأ التسجيل.
ملاحظة: استخدم شاشة التسجيل الخاصة ببرنامج Sophy للتأكيد بصريا على محاذاة العينة وتركيزها ولتحسين معلمات إثارة LED للتسجيل. - أوقف التسجيل وأغلق برنامج Sophy.
- انتقل إلى المحطة ، واستخدم البرنامج المصمم خصيصا للحصول على البيانات الأولية بالتنسيق الثنائي ومعالجتها بعد ذلك (https://github.com/svihra/TimePix3).
- في المحطة الطرفية ، قم بتشغيل الأوامر التالية لتسجيل البيانات:
وثيقة القرص المضغوط / SPIDR / الجذع / الإصدار /
هل
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {اسم الملف} - t {وقت الاستحواذ}
ملاحظة: عند كتابة "ls" ، تحقق من قائمة الملفات في الدليل الحالي ؛ تأكد من رؤية Tpx3daq. - انتظر حتى يتم تسجيل جميع الإطارات.
- لمعالجة البيانات ، قم بتشغيل الأوامر التالية في الجهاز:
وثائق القرص المضغوط / معالجة البيانات / Timepix3 / Timepix3 /
جذر
. L dataprocess.cpp++
.x DRGUI. C - انتظر حتى تفتح نافذة RRGui . حدد جميع المتغيرات على اليسار وجميع البيانات وملف واحد و Centroid على اليمين.
- حدد الملف المراد معالجته وتشغيل مخفض البيانات.
ملاحظة: ستظهر كافة الملفات المعالجة في نفس المجلد مثل الملف الخام.
- في المحطة الطرفية ، قم بتشغيل الأوامر التالية لتسجيل البيانات:
4. تحليل البيانات
- قم بتحليل البيانات التي تمت معالجتها بعد المعالجة باستخدام برنامج مخصص مكتوب بلغة C والذي سيكتب البيانات في ملف صورة .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
- افتح ملفات الصور .ics باستخدام برنامج Time Resolved Imaging المتاح مجانا (انظر جدول المواد). استخدم الدوال الأسية الثنائية لتناسب اضمحلال الفسفرة.
- افتح ملفات الصور .ics المجهزة باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح (انظر جدول المواد).
- باستخدام جداول البحث ، قم بإنشاء صور فسفورية مدى الحياة ، وقم بترميزها بمقياس ألوان زائفة (على سبيل المثال ، اللون الأزرق للأعمار القصيرة والأحمر للأعمار الطويلة). استخدم وظيفة القياس لحساب متوسط قيم العمر للصورة بأكملها أو مناطق اهتمام محددة (ROIs).
- قم بتحويل قيم العمر إلى تركيز الأكسجين باستخدام المعادلة التي تم الحصول عليها من تركيب معايرة O2 للمسبار36.
ملاحظة: استخدمت المعادلة (2) لهذا العمل:
O 2 [ميكرومتر] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بالنسبة لتطبيقات التصوير خارج الجسم الحي ، تم تلطيخ شظايا الأنسجة المعوية من خلال التطبيق الموضعي لمسبار NanO2-IR على الجانب المصلي من الأنسجة. لتلطيخ أعمق ، تم حقن 1 ميكرولتر من المسبار في التجويف. في الحالة الأخيرة ، يحمي جدار الأمعاء بسمك 0.2-0.25 مم المسبار من الكاميرا. يتم توضيح عمليتي التلوين في الشكل 2 أ.
يتم عرض الكثافة الناتجة وصور PLIM في الشكل 2B-G. تعكس الألوان بوضوح الاختلاف في قيم العمر ، وبالتالي الفرق في الأوكسجين في الجانبين المصلي والأغشية المخاطية للأنسجة. يشير الشكل 2C والشكل 2D إلى مجموعات مماثلة من الأنسجة التي تم تلطيخها موضعيا (الشكل 2C) وداخل اللمعة (الشكل 2D). كما هو متوقع ، أظهرت الأنسجة أنماط PLIM مماثلة. ومع ذلك ، أظهر التلوين داخل اللمعة للجانب المخاطي للنسيج (الشكل 2 د) قيما أعلى مدى الحياة ، مما يعكس انخفاض الأوكسجين في السطح الداخلي للأمعاء ، مقارنة بالتلوث الموضعي للجانب المصلي (الشكل 2 ج) ، والذي أظهر عمرا أقل. هذا يعكس ارتفاع الأوكسجين في السطح الخارجي للأمعاء.
لفحص استقرار إشارات العمر والنشاط التنفسي للأمعاء ، تم إجراء تحليل PLIM بفاصل زمني على العينات الملطخة داخل اللمعة على مدار ساعتين (الشكل 2D-G). لوحظت زيادة في قيم العمر بين 15 دقيقة (54.4 ميكروثانية ± 0.9 ميكرو ثانية) و 2 ساعة (61.1 ميكروثانية ± 0.8 ميكرو ثانية) من الحضانة ، مما يعكس انخفاضا في مستويات O2 في الجزء اللمعي من الأمعاء. بالإضافة إلى ذلك ، تثبت مستويات O2 المنخفضة بعد 2 ساعة من الحضانة أن تنفس الأنسجة استمر طوال فترة التشريح والتحضير والتلوين والحضانة وخطوات التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يعزى التغيير في شكل التجويف الملاحظ في الشكل 2D-G إلى توزيع المسبار المحقون في التجويف ، مما يعني أن إشارة LT تعكس المنطقة التي يوجد بها المسبار.
لتقييم الأداء المستقبلي للتصوير في الجسم الحي ، أجريت دراسة أولية حول تصوير نقص الأكسجة في الأورام تحت الجلد المطعمة التي نمت في الفئران مباشرة بعد التضحية (الشكل 3). في هذه الحالة ، تم حقن الفئران Balb / c تحت الجلد في الجناح الأيمن مع 200 ميكرولتر من خليط من خلايا CT26 ، والتي كانت غير ملوثة أو ملطخة بمسبار 0.05 مجم / مل NanO2-IR. تم إجراء PLIM في اليوم السابع من نمو الورم ، وتم التضحية بالفئران قبل التصوير مباشرة (أي بعد الوفاة). تظهر صور مناطق الورم في الفئران في اليوم السابع من النمو في الشكل 3 أ ، ب.
تظهر صور الكثافة (يسار) و PLIM (يمين) لمناطق الورم في الفئران في اليوم السابع من نمو الورم (الشكل 3 ب) أداء وحساسية كل من جهاز التصوير والمسبار في مثل هذه التجارب (لا تظهر بيانات إحصائية أكثر تفصيلا). تم تصوير الحيوانات لمدة 20 ثانية لكل منها. تم حلق الأجنحة اليسرى للفئران وتصويرها على أنها فارغة. لم ينتجوا أي إشارات PLIM. في المقابل ، أنتجت المناطق المصابة بالورم والمسبار إشارات مستقرة مدى الحياة تبلغ ~ 50 ميكرو ثانية. كان الهدف من هذه التجربة هو تقييم قابلية استخدام جهاز التصوير للدراسات في الجسم الحي مع الحيوانات الحية ونماذج الأمراض البشرية. وفي حين أظهر هذا الجزء نتائج نوعية أولية، يجري إعداد ورقة مناظرة توفر تقييما كميا أكثر شمولا.
بعد ذلك ، تم عرض التصوير أيضا في تصوير PLIM لمواد الاستشعار القائمة على أصباغ البورفيرين Pt (II). تم وصف التركيب الكيميائي لصبغة Pt-octaethylporphine (PtOEP) والتفاصيل الفنية لإعداد مواد الاستشعار المقابلة في مكان آخر 6,39. تم تصوير طلاء مستشعر الحالة الصلبة الفسفوري القائم على PtOEP القائم على البوليسترين على فيلم بوليستر شفاف (مايلر) كبقع صغيرة عن طريق غمر الفيلم في مخزن مؤقت PBS (حالة مؤكسجة مشبعة بالهواء) أو في PBS تحتوي على الجلوكوز وأوكسيديز الجلوكوز ، مما يوفر حالة غير مؤكسجة بالكامل. تطابقت إشارات العمر التي تم الحصول عليها في الظروف المؤكسجة (25.6 μs ± 0.5 μs) والظروف غير المؤكسجة (65.7 μs ± 1.5 μs) مع النتائج التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 6. ترد في الشكل 4A ، B ، صور شدة و PLIM لأجهزة الاستشعار المؤكسجة وغير المؤكسجة.
الشكل 1: الإعداد التجريبي لجهاز التصوير38. أعيد طبعها بإذن من Sen et al.38. حقوق الطبع والنشر: جمعية البصريات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: O2 PLIM لعينات أمعاء الفأر الملطخة موضعيا وداخليا. (أ) توضيح طريقتي التلوين باستخدام (ب) شدة الفسفرة و (ج) صور بليم للأمعاء الملطخة موضعيا بمسبار NanO2-IR. (د-ز) الفاصل الزمني PLIM للأمعاء الملطخة داخل اللمعة في 15 دقيقة و 30 دقيقة و 1 ساعة و 2 ساعة بعد تلطيخها. يتم تقديم صور PLIM بمقياس ألوان زائف: اللون الأزرق يتوافق مع عمر أقل ، واللون الأحمر يتوافق مع قيم عمر أعلى. قضبان المقياس = 5 مم. اختصار: PLIM = الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للفسفورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: O2 PLIM من الأورام المطعمة في الأجنحة اليمنى للفئران . (أ) رسم بياني لتطور الورم في الحيوانات الحية. كثافة الفسفرة (يسار) وصور PLIM (يمين) لمناطق الورم في اليوم السابع (B) من نمو الورم. يتم تقديم صورة PLIM بمقياس ألوان زائف: اللون الأزرق يتوافق مع عمر أقل ، واللون الأحمر يتوافق مع قيم عمر أعلى. شريط المقياس = 5 مم. اختصار: PLIM = الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للفسفورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: شدة الفسفرة لبقعة المستشعر القائمة على PtOEP. كثافة الفسفرة (يسار) وصور PLIM (يمين) لبقعة مستشعر PtOEP في الحالة (A) المؤكسجة و (B) غير المؤكسجة. يتم تقديم صور PLIM بمقياس ألوان زائف: الأزرق يتوافق مع عمر أقل ، واللون الأحمر يتوافق مع قيم عمر أعلى. الاختصارات: PLIM = المجهر التصوير مدى الحياة الفسفورية. PtOEP = البلاتين أوكتايثيل بورفيرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم البروتوكولات المذكورة أعلاه وصفا تفصيليا لتجميع جهاز التصوير الجديد وتشغيله في وضع FLIM / PLIM بالميكروثانية. تنتج كاميرا Tpx3Cam من الجيل الجديد المستندة إلى TCSPC ، إلى جانب المحول البصري الميكانيكي Cricket مع مكثف الصورة ومرشح الانبعاثات وعدسة الماكرو ، وحدة بصرية مستقرة ومضغوطة ومرنة سهلة التشغيل. وقد تبين أن جهاز التصوير يعمل بشكل جيد مع مجموعة من العينات المختلفة والمهام التحليلية ، والتي تضمنت توصيف المواد الفسفورية وتصوير الأنسجة الحية O2 . تم استخدام مسبار NanO2-IR القابل للذوبان القائم على الأشعة تحت الحمراء القريبة من Pt (II) - البنزوبورفيرين وأجهزة استشعار الحالة الصلبة القائمة على Pt (II) الباعثة للأحمر في تجارب التصوير. تم استخدام هذه المستشعرات بنجاح للكشف عن الفسفرة المروية ل O2 بسبب تحولها الكبير في ستوكس ، وعمر الانبعاث الطويل ، والحساسية العالية ، والاستجابة السريعة ، والاستقرار الكيميائي الضوئي الجيد.
هذه المجسات المختلفة الحساسة O2 وطلاءات الحالة الصلبة ، عند اختبارها على تصوير الماكرو ، أنتجت نتائج تتفق مع البياناتالمنشورة سابقا 40. أظهرت المواد تماثلا جيدا وتباينا واستجابات مدى الحياة للظروف البيئية المتغيرة ، لا سيما من حيث درجة الحرارة وحالة الأكسجين. تظهر مقارنة هذه النتائج مع تلك التي تم إنتاجها على مجهر TCSPC-PLIM متحد البؤر أن جهاز التصوير الجديد دقيق ، ولديه قراءات مدى الحياة بجودة أفضل ، ويكتسب صور PLIM بسرعة وحساسية عالية28،38،40.
أظهر جهاز التصوير أيضا أداء واعدا مع عينات بيولوجية ملطخة بالفوسفور من أنواع مختلفة. وهكذا ، تم إنتاج خرائط تركيز O2 مفصلة للعينات التي تحتوي على معلقات لخلايا التنفس الملطخة ، والأنسجة الحيوانية الحية بعد الوفاة ، والأعضاء الكاملة ، والأورام المطعمة. قدم جهاز التصوير قياسات لقيم العمر من السطح وحتى على أعماق تصل إلى 0.5 مم داخل الأنسجة28،36،38.
نظرا لأن قيم عمر الفسفرة تتأثر بشدة بدرجة الحرارة41 ، فمن الضروري تنفيذ تحكم صارم في درجة حرارة العينات المصورة ، مثل استخدام مرحلة عينة ساخنة و / أو غرفة حاضنة. أثناء استخدام الإثارة فوق البنفسجية ، من المهم اختيار حاملات العينات بعناية ، حيث تمتلك العديد من المواد تألقا ذاتيا في هذه المنطقة الطيفية ، مما يؤثر على القيمة الحقيقية للعينة. تم إجراء جميع صور PLIM في هذه الدراسة بقوة LED تبلغ 4 فولت وعرض نبضة 50 نانوثانية لفترة تكامل تبلغ 20 ثانية. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذه المعلمات حسب الحاجة. يتم تسجيل ما يقرب من 104500 إطار خلال 20 ثانية من وقت التقاط الصور. أخيرا ، من المهم إجراء القياسات في غرفة مظلمة لتجنب تداخل الضوء المحيط.
وبالتالي ، يمكن لجهاز التصوير PLIM إجراء قياسات سريعة وكمية مدى الحياة باستخدام الأجسام العيانية ذات الحجم الكبير. في حين أن المسح الضوئي بالليزر PLIM-TCSPS ممكن ، إلا أنه سيكون بطيئا جدا بسبب أوقات السكون الطويلة المطلوبة لأصباغ استشعار الأكسجين. ومع ذلك ، فإن هذا التصوير سريع ويمكنه تسجيل جميع وحدات البكسل في وقت واحد. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتأثر القياسات القائمة على الكثافة بتركيز صبغة الفلورسنت / الفسفورية ، وشدة LED أو الليزر غير المستقرة ، والتبييض الضوئي ، ومحاذاة المكونات البصرية ، والتشتت من العينات. في المقابل ، فإن تصوير الماكرو المستند إلى TCSPC مستقل بشكل أساسي عن هذه العوامل. لذلك ، يمكنه إجراء قياسات دقيقة وخالية من المعايرة ل O2. تشمل عيوب الكاميرا معالجة البيانات المعقدة نسبيا وأحجام البيانات الكبيرة (~ 2 جيجابايت).
في المستقبل ، يمكن أيضا استخدام جهاز التصوير ليس فقط لتعيين تركيزات O2 ولكن أيضا المعلمات الكيميائية والكيميائية الحيوية الأخرى للعينات المختبرة ، مثل ديناميكيات الأس الهيدروجيني والجلوكوز ، باستخدام المجسات أو أجهزة الاستشعار المقابلة. هذا يجعلها أداة مفيدة للدراسات الفسيولوجية مع نماذج الأنسجة والأمراض المختلفة. يمكن أيضا ترقية جهاز التصوير للعمل في وضع FLIM نانو ثانية. ومع ذلك ، يتطلب ذلك استبدال مصابيح LED الحالية بمصدر إثارة أسرع (على سبيل المثال ، ليزر ps). تشغيل النظام في وضع PLIM / FLIM المزدوج ممكن أيضا بشكل أساسي.
إجمالا ، يوضح جهاز التصوير البساطة والتنوع ، إلى جانب الوظائف الجيدة والأداء التشغيلي في تطبيقات TCSPC-PLIM واسعة النطاق. تقوم أجهزة التصوير واسعة المجال المتاحة تجاريا في الغالب بالتصوير القائم على الشدة ، حيث يمكن أن تتأثر شدة الفوسفور بعوامل مثل التبييض الضوئي ، وهندسة القياس ، والتشتت من العينات ، وما إلى ذلك. يعتمد جهاز التصوير الحالي على التصوير مدى الحياة ، مما يجعل القياسات كمية أكثر من كونها نوعية. علاوة على ذلك ، فإن دمج الكاميرا البصرية Tpx3Cam مع محول الكريكيت ومكثف الصورة يوفر حساسية الفوتون الواحد والبساطة والمرونة وقوة القياسات. على عكس الأنظمة الأخرى ، يمكن حملها إلى موقع التجارب وتدويرها بزاوية 360 درجة بناء على متطلبات العينة ومهمة القياس. بفضل هدفه الحالي ، الذي يسهل تغييره لعدسة أخرى ، يمكن للتصوير قياس عينات يصل حجمها إلى 18 مم × 18 مم في غضون ثوان قليلة وبدقة مكانية عالية تبلغ 256 بكسل × 256 بكسل. يصف هذا البحث الإجراءات خطوة بخطوة لكيفية تحضير العينات للاختبار واستخدام جهاز التصوير في تطبيقات PLIM المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
الدعم المالي لهذا العمل من مؤسسة العلوم في أيرلندا ، والمنح SFI / 12 / RC / 2276_P2 و SFI / 17 / RC-PhD / 3484 و 18 / SP / 3522 ، وأبحاث السرطان الخارقة (علم الأورام الدقيق أيرلندا) معترف بها بامتنان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
