Microdisección del ojo de roedor
Summary
Este artículo presenta un protocolo para la microdisección ocular en roedores. El proceso implica la enucleación del globo ocular junto con la membrana nictitante (es decir, el tercer párpado). Esto es seguido por la separación de las copas oculares posterior y anterior.
Abstract
La microdisección ocular del ojo de roedor implica la segmentación del globo ocular enucleado con la membrana nictitante adjunta, o tercer párpado, para obtener los oculares anterior y posterior. Con esta técnica, las subpartes del ojo, incluido el tejido corneal, el tejido neural, el tejido epitelial pigmentario de la retina (EPR) y la lente, se pueden obtener para montajes completos, criosección y / o suspensiones unicelulares de un tejido ocular específico. La presencia del tercer párpado presenta ventajas únicas y significativas, ya que beneficia el mantenimiento de la orientación del ojo, lo cual es importante para comprender la fisiología ocular después de cualquier intervención localizada o en estudios que involucran análisis oculares relacionados con la topografía espacial del ojo.
En este método, enucleamos el globo ocular en la cavidad junto con el tercer párpado cortando cuidadosa y lentamente los músculos extraoculares y cortando el nervio óptico. El globo ocular fue perforado a través del limbo corneal usando una microcuchilla. La incisión se utilizó como punto de entrada, lo que permitió cortar a lo largo de la unión córnea-escleral insertando microtijeras a través del punto de incisión. Se hicieron pequeños y continuos cortes a lo largo de la circunferencia hasta que las copas se separaron. Estos podrían diseccionarse aún más pelando suavemente la capa translúcida de la retina neural utilizando pinzas de sutura Colibrí para obtener las capas de retina neural y EPR. Además, se hicieron tres/cuatro cortes equidistantes desde la periferia perpendicularmente al centro óptico hasta que se alcanzó el nervio óptico. Esto abrió las copas hemisféricas en forma de florete para que cayeran planas y pudieran montarse fácilmente. Esta técnica se ha utilizado en nuestro laboratorio para montajes completos de córnea y secciones de retina. La presencia del tercer párpado delinea la orientación nasal-temporal, lo que permite el estudio de diversas intervenciones de terapia celular después del trasplante y, por lo tanto, la validación fisiológica dirigida vital para la visualización y la representación precisa en dichos estudios.
Introduction
La disección ocular es una técnica importante en la investigación oftalmológica y ha permitido a los investigadores acceder a los segmentos del ojo para estudios específicos. Anteriormente, los investigadores oculares se basaban en el tejido ocular de individuos enfermos para sus estudios. Sin embargo, el número progresivamente creciente de cepas de modelos de roedores oftálmicos1 a lo largo de los años ha disminuido la necesidad de tejido ocular humano. Estas cepas de ratón han permitido una comprensión más profunda de las enfermedades oculares y las intervenciones. Sin embargo, también han generado la necesidad de técnicas innovadoras de microdisección ocular. El pequeño tamaño y el área limitada de operación limitan severamente el acceso efectivo a las subpartes oculares. Además, debido al ensamblaje celular homogéneo de los oculares posterior y anterior, es difícil realizar intervenciones específicas después de la disección. Las técnicas actuales de microdisección del láser2 y la microdisección quirúrgica 3,4 son inadecuadas para cumplir con tales requisitos de investigación ocular. La microdisección con láser es muy eficaz en el análisis de células individuales, pero el tejido específico debe ser microdiseccionado antes del procedimiento con láser2. La técnica puede aislar pequeñas regiones de interés de un tejido prediseccionado para el análisis molecular. Por lo tanto, la técnica no es adecuada para preparar monturas enteras o para el aislamiento de capas oculares empaquetadas axialmente para una visualización óptima.
El método quirúrgico es la técnica más utilizada; Este método consiste en inmovilizar el ojo a través del nervio óptico5 y luego realizar la disección. Esta práctica es ardua y puede dañar cualquier tejido frágil, ya que el ojo esférico continúa moviéndose durante la disección. A pesar de ser beneficiosa para aislar las diversas secciones de las capas de la retina, la técnica no puede demarcar la orientación espacial del tejido en la disección.
Durante la disección, mantener la presencia de la membrana nictitante adherida o del tercer párpado (Figura 1) presenta ventajas únicas y significativas. En este método, primero, el globo ocular se enuclea con el tercer párpado. Luego, el tercer párpado se utiliza para inmovilizar el ojo6 (Figura 2A). Esto es seguido por la perforación del globo ocular a través del limbo corneal y el uso de la incisión como punto de entrada (Figura 2B, C). Luego, los oculares se separan cortando a lo largo de la circunferencia anterior y posterior (Figura 2D-G). Al diseccionar aún más el ocular posterior, la capa translúcida de la retina neural se puede identificar y despegar suavemente. Luego se realizan tres o cuatro cortes equidistantes en las copas hemisféricas anteriores y posteriores obtenidas, que permiten que estas copas en forma de flor caigan planas sobre un portaobjetos (Figura 2H).
El tercer párpado ayuda a un manejo fácil y eficiente durante la disección, asegurando así un daño mínimo al tejido mientras se accede a las diversas capas oculares y al producir montajes completos. Además, la presencia del tercer párpado ayuda a localizar y examinar intervenciones localizadas durante la visualización.
El procedimiento, en nuestro laboratorio, se ha realizado en una cepa de ratón CBA / J o rd1 en P28 de cualquier sexo. El procedimiento se puede realizar en cualquier cepa, edad o sexo del animal y no tiene sesgo de acuerdo con estas características.
Los animales fueron adquiridos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales) y mantenidos en la Instalación de Animales Pequeños (SAF) en el Instituto Nacional de Inmunología (NII). Se mantuvieron en jaulas ventiladas individuales (IVC) y recibieron acceso ad libitum a agua y alimentos acidificados en autoclave. Se mantuvieron a 21-23 °C y con un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h.
A continuación se muestra un método quirúrgico modificado para la microdisección de un ojo de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha encontrado que la microdisección ocular es una tarea difícil debido al pequeño tamaño y la forma esférica del ojo del roedor, y el ojo del roedor requiere técnicas innovadoras para un manejo eficiente8.
En el método demostrado actual, el globo ocular de ratón enucleado se obtiene con el tercer párpado unido para un manejo efectivo y fácil. Usando el tercer párpado, el globo ocular se puede inmovilizar por completo, lo que permite que la disección proc…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Dr. Alaknanda Mishra, Departamento de Biología Celular y Anatomía Humana, Universidad de California Davis, EE.UU., nos capacitó en este método en el Instituto Nacional de Inmunología, Nueva Delhi. Este trabajo fue apoyado por la subvención básica recibida del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India al Instituto Nacional de Inmunología de Nueva Delhi. P.S. recibió una beca de investigación del Departamento de Biotecnología.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referenzen
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