Summary
Vi rapporterer et trinn-topp, fleksibelt miljøkammer for time-lapse-avbildning av levende celler ved hjelp av oppreist stimulert Raman-spredningsmikroskopi med overført signaldeteksjon. Lipiddråper ble avbildet i SKOV3-celler behandlet med oljesyre i opptil 24 timer med 3 minutters tidsintervall.
Abstract
Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en etikettfri kjemisk bildebehandlingsteknologi. Levende celleavbildning med SRS har blitt demonstrert for mange biologiske og biomedisinske applikasjoner. Imidlertid har langsiktig time-lapse SRS-avbildning av levende celler ikke blitt mye vedtatt. SRS-mikroskopi bruker ofte et høyt numerisk blenderåpning (NA) vann-nedsenkingsmål og en høy NA olje-nedsenkingskondensator for å oppnå høyoppløselig avbildning. I dette tilfellet er gapet mellom målet og kondensatoren bare noen få millimeter. Derfor kan de fleste kommersielle scene-topp miljøkamre ikke brukes til SRS-avbildning på grunn av deres store tykkelse med et stivt glassdeksel. Dette papiret beskriver design og fabrikasjon av et fleksibelt kammer som kan brukes til time-lapse live-celleavbildning med overført SRS-signaldeteksjon på en oppreist mikroskopramme. Kammerets fleksibilitet oppnås ved å bruke et mykt materiale - en tynn naturgummifilm. Det nye kabinettet og kammerdesignet kan enkelt legges til et eksisterende SRS-bildeoppsett. Testingen og foreløpige resultater viser at det fleksible kammersystemet muliggjør stabil, langsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levende celler, som kan brukes til ulike bioimaging-applikasjoner i fremtiden.
Introduction
Optisk mikroskopi brukes til å observere mikrostrukturer av prøver. Optisk bildebehandling er rask, mindre invasiv og mindre ødeleggende enn andre teknologier1. Levende celleavbildning med optisk mikroskopi er utviklet for å fange dynamikken til dyrkede levende celler over en lang periode2. Ulike typer optiske kontraster gir tydelig informasjon om biologiske prøver. For eksempel viser optisk fasemikroskopi den subtile forskjellen i brytningsindeksene over prøven3. Fluorescensmikroskopi er mye brukt til å avbilde spesifikke biomolekyler eller cellulære organeller. Imidlertid resulterer bredbåndseksitasjon og emisjonsspektra av fluorescens vanligvis i spektral overlapping når flerfarget avbildning utføres4. Fluorescerende molekyler er lysfølsomme og kan blekes etter langvarig, periodisk lyseksponering. I tillegg kan fluorescensmerking endre biofordelingen av molekylene i celler5. SRS-mikroskopi er en merkefri kjemisk bildebehandlingsteknologi6. Kontrasten til SRS er avhengig av vibrasjonsovergangen til spesifikke kjemiske bindinger. Vibrasjonsfrekvensen til en kjemisk binding viser ofte en smal spektral båndbredde, noe som gjør det mulig å avbilde flere Raman-bånd i de samme prøvene7. SRS-mikroskopi er et unikt verktøy for levende celleavbildning, og gir flere kjemiske kontraster på en etikettfri måte8.
Mens SRS-avbildning av ufargede celler har blitt brukt i mange studier, har langsiktig time-lapse SRS-avbildning av levende celler ikke blitt mye vedtatt. En grunn er at kommersielle åpne kamre ikke kan brukes direkte til SRS-avbildning på grunn av deres store tykkelse 9,10,11,12. Disse kamrene med glasslokk er for det meste designet for lysfelt- eller fluorescensavbildning ved bruk av et enkelt høyt NA-objektiv med et bakoverdeteksjonsskjema. SRS-avbildning foretrekker imidlertid overført deteksjon ved bruk av både et høyt NA-mål og en høy NA-kondensator, noe som bare etterlater et veldig kort gap (vanligvis noen få millimeter) mellom målet og kondensatoren. For å overvinne dette problemet designet vi et fleksibelt kammer ved hjelp av et mykt materiale for å muliggjøre time-lapse SRS-avbildning av levende celler ved hjelp av en oppreist mikroskopramme. I dette designet ble vanndyppemålet innelukket i det myke kammeret og kan fritt bevege seg i tre dimensjoner for fokusering og avbildning.
Den optimale temperaturen for dyrking av de fleste pattedyrceller er 37 °C, mens romtemperaturen alltid er 10° lavere enn dette. Temperatur høyere eller lavere enn 37 °C har en dramatisk effekt på celleveksthastigheten13. Derfor er temperaturkontroll av cellekulturmiljøet nødvendig i et levende cellebildesystem. Det er kjent at temperaturstabilitet vil føre til defokuseringsproblemer under langsiktig avbildning14. For å oppnå et stabilt miljø på 37 °C bygde vi et stort kapslingskammer for å dekke hele mikroskoprammen, inkludert et varmeisolerende lag under mikroskopet (figur 1). Innenfor det store temperaturkontrollkammeret bidrar det lille fleksible kammeret til å opprettholde den fysiologiske fuktigheten og pH-verdien nøyaktig via den regulerte luftstrømmen supplert med 5 % CO 2 (figur 2). Temperatur og luftfuktighet i kamrene ble målt for å bekrefte at dobbeltkammerdesignet ga optimal cellekulturtilstand for cellevekst under langvarig, periodisk SRS-avbildning (figur 3). Deretter demonstrerte vi anvendelsen av systemet for time-lapse-avbildning og sporing av lipiddråper (LD) i SKOV3-kreftceller (figur 4, figur 5 og figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bygg mikroskopets miljøkabinett
MERK: Dette store mikroskopets miljøkapsling brukes til å kontrollere temperaturen på mikroskoplegemet og bildemiljøet som skal stabiliseres ved 37 °C (figur 1A).
- Merk plasseringen av føttene til SRS-mikroskoprammen og det motoriserte trinnet ved hjelp av en markørpenn på det optiske bordet. Monter to Iris-membraner foran mikroskopets galvanometerskanner og juster for å få pumpen og Stokes laserstråler til å passere gjennom midten av Iris-membranene.
- Fjern mikroskoprammen og scenen fra det optiske bordet.
- Legg silikongummiplaten (størrelse: 31 x 29 tommer, tykkelse: 1/8 tommer) på det optiske bordet (figur 1B).
- Klipp silikongummien langs merkene med en kniv, fjern små gummibiter og plasser de firkantede MICA-keramiske arkene (størrelse: 6 x 6 tommer, tykkelse: 1/4 tommer) på samme steder.
MERK: MICA keramikk er et lett-å-maskin materiale15. Det er like hardt som aluminium, men er en utmerket varmeisolator. MICA keramiske plater ble brukt til å stoppe varmeoverføring fra metallmikroskoprammen og scenen til det optiske bordet i rustfritt stål. Noen få gjennomgående hull bør bores på MICA-arkene for å tillate bruk av 1/4-20 skruer for montering av føttene på rammen og scenen. - Flytt mikroskoprammen og scenen tilbake til det optiske bordet og juster føttene forsiktig på MICA-keramiske ark langs markørlinjene. Bruk 1/4-20 skruer for å montere rammen og scenen på bordet.
- Juster den optiske SRS-banen. Juster speilfestene til speil 1 og speil 2 for å få laserstrålen til å passere gjennom midten av de to forhåndsmonterte irismembranene (figur 2).
MERK: Tekniske detaljer om det laboratoriebygde SRS-mikroskopet som brukes til det nåværende levende cellebildearbeidet er beskrevet tidligere16. Pulsbredden på pumpen og Stokes-bjelkene er ~ 3-4 ps med glassstangspredning. Systemet styres ved hjelp av programvaren ScanImage17 . - På toppen av dette varmeisolasjonsfundamentet, monter miljøkabinettet for å dekke hele mikroskoprammen ved hjelp av fem stykker store polykarbonatark (størrelse: 31 x 29 x 28 tommer, tykkelse: 0,25 tommer).
MERK: Størrelsen på kapslingsboksen bestemmes ut fra dimensjonene til mikroskoprammen og scenen. Frontpanelet på mikroskopets kapslingsboks må fjernes midlertidig for å installere det fleksible kammeret og laste cellekulturfatet.- For å montere kabinettet, utfør enkelt maskineringsarbeid, inkludert kutting, boring og tapping av skruehull på hver kant av polykarbonatarkene. Klipp to store hull med en diameter på 2,6 tommer på høyre og venstre ark i kabinettet for å passe til henholdsvis innløps- og utløpsslangen. Klipp et lite hull med en diameter på 5 mm på bakplaten for å la laserstrålene komme inn i kabinettet.
- Forsegl kantene og grensesnittene på esken ved hjelp av aluminiumsfoliebånd.
- Koble den fleksible kanalslangen til innløpet og utløpsportene på kapslingsboksen for å tillate sirkulert varmluftstrøm pumpet og styrt av varmemodulen. Plasser varmesensoren til varmemodulen i det fleksible kammeret der cellene dyrkes og avbildes. Sett ønsket temperatur til 37 °C.
MERK: En diffusor kan brukes til å få en mer jevn luftstrømfordeling i miljøkapslingen.
2. Monter det fleksible kammeret
- Monter det maskinerte hule sylindriske aluminiumsstykket 1 (materiale: aluminium 6061) på nesestykket på objektivet ved hjelp av tre settskruer (figur 2).
- Monter det maskinerte hule sylindriske aluminiumsstykket 2 på prøveholderen med fire 1/4-20 skruer (figur 2).
MERK: Prøveholderen må modifiseres slik at den holder til cellekulturfatet med 50 mm glassbunn. Bor et gjennomgående hull i midten av prøveholderen ved hjelp av en 1-7/8 tommers hullsag. Møt hullet med en 50 mm hullsag og hold dybden på gjennomgående hull ~ 1 mm. - Monter prøveholderen med aluminiumsstykke 2 på det motoriserte trinnet og monter det med skruer.
- Plasser naturgummifilmhylsen (tykkelse: 0,01 tommer, limt med cyanoakrylat lim) mellom de to maskinerte aluminiumsstykkene og monter den med gummibånd i hver ende.
- Koble den komprimerte CO2 -sylinderen til gassblandermodulen ved hjelp av riktige rør og kontakter. Sett CO2 -inngangstrykket til 20-25 psi. Bruk en innebygd CO 2 -sensor og en kontroller for å sikre at luftblandermodulen kan regulere og blande 5% CO2 inn i luftstrømmen. Bruk innebygde filtre for å rense luftstrømmen.
- Bruk riktig slange og kontakter, led blandingsluften (med 5% CO2) til den presteriliserte vannflasken plassert på kokeplaten, og led deretter den fuktede luften til det fleksible kammeret. Sett kokeplaten på 37 °C. Boble luftstrømmen i det varme vannet for å øke luftfuktigheten.
3. Forberedelse for time-lapse live-cell SRS imaging eksperimenter
- Tørk av alle deler av det fleksible kammeret med 70 % etanol, inkludert nesestykket, målet for vanndypping og prøveholderen.
- Dekontaminer hele kapslingssystemet ved hjelp av en UV-lampe plassert i kabinettet i 20 til 30 minutter.
MERK: Ikke opphold deg i laboratorierommet under UV-desinfeksjonsprosessen for sikkerhet. - Kultur SKOV3 celler i en 50 mm glassbunn petriskål i 12 timer under normale fysiologiske forhold i en vanlig inkubator.
MERK: Start SKOV3 cellekultur18 i et standard biosikkerhetsskap. - Koble det maskinerte aluminiumsstykket 2 fra prøveholderen ved å fjerne skruene.
MERK: Dette er måten å åpne det fleksible kammeret for å laste cellekulturfatet. - Legg i cellekulturfatet. Husk å tilsette nedsenkningsolje på toppen av kondensatoren før du legger cellekulturfatet. Fjern dekselet på fatet og immobiliser parabolen ved hjelp av klemmene.
NOTAT: For å unngå forurensning, bør alle operasjonene utføres med hansker. - Senk målet inn i cellekulturmediet for grovfokusering. Senk aluminiumsstykket 2 for å omslutte det fleksible kammeret og monter det på prøveholderen ved hjelp av skruer.
NOTAT: En 2 mm putepute i silikongummi er festet til bunnen av aluminiumsstykket 2 for å forsegle gapet tett. - Still lufttilførselen med 5% CO 2 og 19% O2 for normal cellekultur med en luftstrømningshastighet på 200 cc / min.
MERK: En lavere luftstrømningshastighet kan brukes. Det avhenger av hvor godt det fleksible kammeret er forseglet.
4. Gjennomfør time-lapse live-celle SRS-bildebehandlingseksperimenter
- Still inn laserbølgelengden til 805 nm for å målrette 2854 cm-1 Raman-skiftet , som tilskrives vibrasjonen avCH2 kjemiske bindinger. Bruk lav lasereffekt for å redusere fotoskader på cellene. For å følge denne protokollen, bruk ~ 15 mW gjennomsnittlig effekt på pumpelaseren og ~ 7,5 mW av Stokes-laseren (fast ved 1,045 nm) for langsiktig live-celleavbildning.
MERK: Høyere lasereffekt vil gi bedre SRS-bildekvalitet. Imidlertid vil for høy lasereffekt indusere fotoskade på levende celler. Det er en avveining mellom bildekvalitet og fotoskader. - Juster og fokuser målet for å oppnå god SRS-avbildning av cellene ved hjelp av FOCUS-knappen på MAIN CONTROLS-panelet i programvaren. Hvis du vil utføre rask fokusering, angir du bildepunkttallet til 512 × 512 piksler med en pikseloppholdstid på 4,8 μs på KONFIGURASJON-panelet.
- Sett inngangsområdet for låseforsterkeren (vanligvis 5 mV) til å være to ganger maksimal signalspenning. Angi at lavpassfilteret skal være det samme som pikseloppholdstiden (4,8 μs).
MERK: Ulike laboratoriebygde SRS-systemer kan bruke forskjellige datainnsamlingsinnstillinger. - Etter å ha oppnådd god fokusering, sett bildeoppløsningen til 2,048 × 2,048 piksler for et 175 μm2 synsfelt for oppkjøp av bilder av høy kvalitet. Kontroller SAVE-funksjonen på MAIN CONTROLS-panelet og kontroller SRS-kanalen på CHANNELS-panelet . Angi intervalltiden mellom to bilder til 180 s (3 min) på MAIN CONTROLS-kanalen. Sett anskaffelsesnummeret til 480 for time-lapse-avbildning over 24 timer.
MERK: En lavere bildeoppløsning kan brukes basert på formålet med eksperimentene. - Start automatisert bildeinnsamling ved hjelp av LOOP-funksjonen på MAIN CONTROLS-panelet .
MERK: Kontroller om det er fokaldrift på grunn av temperaturstabilitet i den første timen av avbildningen. Den første timeavbildningen er kanskje ikke stabil. Sjekk fokus hver 2-3 t i løpet av time-lapse imaging økten. - Behandle de innsamlede bildene ved hjelp av ImageJ19. Bruk følgende to metoder for LD-kvantifisering: (i) LD/cellekroppsarealforholdet, og (ii) gjennomsnittlig SRS-intensitet for totalt LD. Mål celleområdet ved å terskelere og nullstille de ikke-cellulære pikslene i SRS-bildene ved 2 854 cm-1. Mål LD-området og -intensiteten ved å terskelbegrense og nullstille ikke-LD-bildepunktene i SRS-bildene.
MERK: Flere detaljer om SRS bildebehandling ble rapportert tidligere16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi produserte og monterte det fleksible kammersystemet for time-lapse SRS-avbildning (figur 1 og figur 2), og evaluerte deretter systemets ytelse. Temperaturen inne i mikroskopets miljøkapsling nådde forventet 37 °C innen 1 time, noe som ikke påvirket romtemperaturen signifikant (figur 3A). Temperaturen i det fleksible kammeret nådde 37 °C på 1,5 timer, og den ble stabilt opprettholdt ved 37 °C i minst 24 timer (figur 3B). Den relative fuktigheten i det fleksible kammeret kan nå 85 % på 1 time, og deretter opprettholdes i minst 24 timer (figur 3C). De målte temperatur- og fuktighetsdataene bekrefter at dette systemet kan gi et optimalt miljø for langsiktig cellevekst.
Levende celleavbildning med SRS har blitt brukt på mange biologiske og biomedisinske studier 20,21,22,23,24. Spesielt SRS-avbildning av etikettfrie LD-er i levende celler for å forstå lipidmetabolisme i kreft har trukket mye oppmerksomhet16,25,26. Ved hjelp av det designede fleksible kammersystemet utførte vi først time-lapse SRS-avbildning av levende SKOV3-celler i 24 timer med et tidsintervall på 3 minutter (figur 4). Videodataene viste den raske og aktive bevegelsen av intracellulære LD-er med en tidsmessig oppløsning på 3 minutter. Ved slutten av 24 timers bildebehandling viste cellene fortsatt normal morfologi og tetthet, noe som indikerer at cellene var sunne. Vi avbildet deretter SKOV3-celler behandlet med oljesyre (OA) og sporet den dynamiske prosessen med LD-akkumulering innen 10 timer (figur 5A).
LD-mengdene ble kvantifisert i OA-behandlede SKOV3-celler på to måter (LD til cellekroppsarealforhold og total SRS-intensitet av LD-ene) ved bruk av ImageJ19. Resultatene indikerer at mengden LD (i størrelse og antall) fortsatte å øke over 10 timer (figur 5B). Vi demonstrerte også samtidig fremover-SRS-avbildning av LDs (pseudofarge grønn) og bakover to-foton fluorescens (TPF) avbildning av lysosomer (pseudofarge rød) merket med et fluorescensfargestoff DND-189 (figur 6). Det bemerkes at SRS / TPF dual-modalitetsavbildning kan brukes til å analysere kolokalisering av to cellulære rom. I dette forsøket ble det observert en svært lav grad av samlokalisering av LD og lysosomer, noe som ble indikert av de små gule områdene. Samlet viser disse resultatene at det fleksible kammersystemet muliggjør stabil, langsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levende celler, som kan brukes til ulike bildebehandlingsapplikasjoner i fremtiden.
Figur 1: Det fleksible kammersystemet for time-lapse SRS-avbildning av levende celler. (A) Skjematisk fremstilling av det fleksible kammersystemet for time-lapse SRS-avbildning av levende celler. (B) Bildet til venstre viser det varmeisolerende laget ved hjelp av en silikongummiplate og MICA keramiske pads under mikroskoprammen og scenen. Bildet til høyre viser miljømikroskopets kabinett og det fleksible kammeret. Forkortelser: SRS = stimulert Raman-spredning; CCM = kubikkcentimeter per min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk og bilder av det fleksible kammeret med den optiske SRS-banen, som tillater tredimensjonal fri bevegelse av vanndyppemålet for fokusering og avbildning. De venstre bildene viser de to maskinerte aluminiumsmodulene koblet til et kommersielt objektivt nesestykke og en modifisert prøveholder. De nederste bildene viser monteringens fleksible kammersystem. Forkortelse: SRS = stimulert Raman-spredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Temperatur- og fuktighetsdata for mikroskopkapslingen og det fleksible kammeret. (A) De målte temperaturdataene for mikroskopkapslingen og laboratorieromtemperaturen, opptil 12 timer. (B) De målte temperaturdataene (gjennomsnitt ved 37 °C) i det fleksible kammeret, opptil 24 timer. (C) De målte relative fuktighetsdataene (gjennomsnittlig ved 85 %) i det fleksible kammeret, opptil 24 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative 24 bilder med time-lapse SRS-avbildning. Time-lapse SRS-avbildning (ved 2,854 cm-1) av levende SKOV3-celler ved hjelp av det fleksible kammeret, opptil 24 timer. I dette forsøket ble 480 bilder registrert med et fast tidsintervall på 3 min. Cellene ble dyrket under normale forhold. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Time-lapse SRS-avbildning og lipiddråpekvantifisering. (A) Representativ 10 rammer med time-lapse SRS-avbildning (ved 2,854 cm-1) av levende SKOV3-celler behandlet med 500 μM OA, opptil 10 timer, ved bruk av det fleksible kammeret. I dette forsøket ble 200 bilder registrert med et fast tidsintervall på 3 min. Skala bar = 50 μm. (B) Mengden LD versus tid (0-10 timer) ble kvantifisert på to måter (LD / celle kroppsarealforhold og total SRS-intensitet av LD) ved hjelp av terskelfunksjonen og partikkelanalysefunksjonene i ImageJ. Forkortelser: SRS = stimulert Raman-spektroskopi; OA = oljesyre; LD = lipiddråper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Time-lapse, samtidig SRS og to-foton fluorescensavbildning for LDs og lysosomer. Time-lapse, samtidig SRS (ved 2,854 cm-1), og to-foton fluorescensavbildning for LD (pseudofarge grønn) og lysosomer (rød), opptil 2 timer. Cellene ble behandlet med fluorescensfargestoff (LysoSensor DND-189, 1 μM) i 1 time før avbildning. Bildene ble tatt hvert 3. Skala bar = 50 μm. En lav grad av samlokalisering av LD og lysosomer ble observert, indikert med den gule fargen. Forkortelser: SRS = stimulert Raman-spektroskopi; LD = lipiddråper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi er en alternativ bildebehandlingsteknikk for molekylsporing på en etikettfri måte. Sammenlignet med fluorescensmerking er SRS-avbildning fri for fotobleking, noe som muliggjør langsiktig overvåking av molekyler. Men til dags dato er levende cellebildesystem på en oppreist SRS-mikroskopi ikke kommersielt tilgjengelig. I dette arbeidet ble det utviklet et levende celleavbildningssystem med en stabil termisk isolert mikroskopkapslingsboks og et fleksibelt indre mykt kammer for å muliggjøre overført SRS time-lapse-avbildning. I dette oppsettet opprettholder den store kapslingsboksen temperaturstabilitet ved 37 °C, mens det interne myke kammeret leverer fuktet luft for å etablere et optimalt cellekulturmiljø. Det fleksible åpne kammeret demonstrert i dette arbeidet muliggjør en enkel arbeidsflyt for langsiktig SRS-avbildning av levende celler. Celler sådd i en glassbunnsfat kan først tilberedes og dyrkes i en vanlig inkubator før de overføres til det fleksible kammeret på scenen for avbildning. En alternativ løsning for å utføre live-cell SRS-avbildning er å bruke en lukket strømningscelle, inkludert mikrofluid- og flowcytometriplattformene27,28,29,30. Det er mulig å designe en flytcelle med lavere tykkelse. Dyrking av celler i et perfusjonskammer kan imidlertid være teknisk utfordrende31.
Fokaldrift er et vanlig problem i levende celleavbildning32. Som en multifoton prosess krever generering av SRS-signal en tett fokusering av laserstrålene, og derfor er SRS-mikroskopi svært følsom for fokaldrift. Temperaturstabilitet er en viktig faktor for å indusere fokaldrift. For å forbedre termisk stabilitet ble hele mikroskopet lukket med varmeisolerende materialer. Men i noen bildebehandlingsøkter opplevde vi fortsatt fokaldrift etter 2-3 timers bildebehandling. SRS-mikroskopisk avbildning er også følsom for vibrasjoner, noe som kan ødelegge fokusering. Et anti-vibrasjons optisk bord bidrar til å redusere vibrasjoner for å oppnå stabil avbildning. For å løse fokuseringsproblemet kan autofokusteknologier i fremtidige eksperimenter tas i bruk33.
Desinfeksjonsprosedyren til bildebehandlingssystemet er kritisk for å unngå forurensning av cellene, spesielt for målet om nedsenking i vann, som vil komme direkte i kontakt med cellekulturmediet. Det skal være trygt å bruke 70% etanol til rengjøring av linsen. Fordi UV-lys bare effektivt kan desinfisere overflaten av gjenstandene, ble fire UV-lamper montert på forskjellige steder i kabinettet for å utføre desinfeksjon i disse forsøkene. UV-lyset kan imidlertid forringe plastkomponentene i bildesystemet. I dette tilfellet kan man bruke aluminiumsfolie til å pakke inn og dekke plastdelene. For levende celleavbildning anbefales antibiotika (vanligvis 100 enheter / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin i kulturmediet).
Vi avbildet og kvantifiserte LD-ene i levende kreftceller i disse forsøkene. For disse forsøkene var et 3 min tidsintervall rimelig. Det bemerkes at bildetidsintervallet kan endres avhengig av forskningsprosjektets behov. For eksempel, for å spore en enkelt LD i en levende celle, kan det være nødvendig med et tidsintervall på mindre enn 1 minutt. Derimot er et lengre tidsintervall på noen få minutter tilstrekkelig til å spore langsomme biologiske prosesser34.
SRS-avbildning bruker høyere laserkraft for eksitasjon enn mange andre optiske bildebehandlingsteknologier, noe som kan være utfordrende for langsiktig time-lapse SRS-avbildning av levende celler. SRS-avbildning av de innfødte biomolekylene er enda mer utfordrende på grunn av det lille Raman-tverrsnittet av de kjemiske bindingene35. I disse forsøkene ble det brukt en 15 mW pumpelaser ved 805 nm og 7,5 mW Stokes laser ved 1,045 nm, og ingen signifikant fotoskade ble observert i 24 timer med et 3 minutters tidsintervall. Bruk av sensitive Raman-tagger kan redusere lasereffekten ytterligere36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza og James Walsh) ved Binghamton University for design, fabrikasjon og testing av mikroskopets kabinettboks. Vi takker Scott Hancock, Olga Petrova og Fabiola Moreno Olivas ved Binghamton University for nyttige diskusjoner. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health under tildelingsnummer R15GM140444.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
