Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.
Abstract
Die Umkehrung der immunsuppressiven Natur der Tumormikroumgebung ist entscheidend für die erfolgreiche Behandlung von Krebserkrankungen mit Immuntherapeutika. Mauskrebsmodelle sind in ihrer Vielfalt extrem begrenzt und leiden unter einer schlechten Translation in die Klinik. Um als physiologisches präklinisches Modell für Immuntherapiestudien zu dienen, wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Behandlung menschlicher Tumore in einer Maus zu bewerten, die mit einem menschlichen Immunsystem rekonstituiert wurde. Dieses einzigartige Protokoll demonstriert die Entwicklung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS, “humanisiert”) und anschließend die Implantation eines menschlichen Tumors, entweder eines von der Zelllinie abgeleiteten Xenotransplantats (CDX) oder eines vom Patienten abgeleiteten Xenotransplantats (PDX). HIS-Mäuse werden durch Injektion von CD34+ humanen hämatopoetischen Stammzellen, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, in neonatale BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) stark immundefiziente Mäuse erzeugt, die auch in der Lage sind, einen xenogenen Tumor zu akzeptieren. Die Bedeutung der Kinetik und Eigenschaften der Entwicklung des menschlichen Immunsystems und der Tumorimplantation wird betont. Abschließend wird eine eingehende Beurteilung der Tumormikroumgebung mittels Durchflusszytometrie beschrieben. In zahlreichen Studien, in denen dieses Protokoll verwendet wurde, wurde festgestellt, dass die Tumormikroumgebung einzelner Tumore in HIS-PDX-Mäusen rekapituliert wird; “heiße” Tumore weisen eine große Immuninfiltration auf, während “kalte” Tumore dies nicht tun. Dieses Modell dient als Testfeld für Kombinationsimmuntherapien für ein breites Spektrum menschlicher Tumore und stellt ein wichtiges Werkzeug auf dem Weg zur personalisierten Medizin dar.
Introduction
Krebsmodelle von Mäusen sind wichtig für die Aufklärung grundlegender Mechanismen des Tumorwachstums und der Immunflucht. Krebsbehandlungsstudien in Mausmodellen haben jedoch aufgrund begrenzter syngener Modelle und speziesspezifischer Unterschiede zu einer begrenzten Translation in die Klinik geführt 1,2. Das Aufkommen von Immuntherapien als dominanter Ansatz zur Kontrolle von Tumoren hat die Notwendigkeit eines In-vivo-Modells mit einem funktionierenden menschlichen Immunsystem erneut verdeutlicht. Fortschritte bei Mäusen mit menschlichem Immunsystem (HIS-Mäuse) in den letzten zehn Jahren haben es ermöglicht, die Immunonkologie in vivo bei einer Vielzahl von Krebsarten und Immuntherapeutika zu untersuchen 3,4,5,6. Humane Tumormodelle, einschließlich von Zelllinien und Patienten stammender Xenotransplantate (CDX bzw. PDX), wachsen in HIS-Mäusen gut und sind in den meisten Fällen nahezu identisch mit ihrem Wachstum im immundefizienten Wirt, dem die humane hämatopoetische Transplantation fehlt 7,8. Basierend auf dieser zentralen Erkenntnis haben die Forscher das HIS-Mausmodell verwendet, um menschliche Immuntherapien zu untersuchen, einschließlich Kombinationstherapien, die darauf ausgelegt sind, die Tumormikroumgebung (TME) zu verändern, um die Immunsuppression zu verringern und so die immungerichtete Tumorabtötung zu verbessern. Diese präklinischen Modelle tragen dazu bei, die Probleme der Heterogenität menschlicher Krebserkrankungen zu lösen, und können auch den Behandlungserfolg vorhersagen sowie immunbedingte Arzneimitteltoxizitäten überwachen 9,10.
Die Herstellung eines Mausmodells mit menschlichem Immunsystem durch die Einführung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen erfordert eine immundefiziente Maus, die das Xenotransplantat nicht abstößt. Aktuelle HIS-Mausmodelle basieren auf immundefizienten Mausstämmen, über die vor über 30 Jahren berichtet wurde. Der erste beschriebene immundefiziente Mausstamm waren SCID-Mäuse, denen T- und B-Zellen fehlten11, gefolgt von einem hybriden NOD-SCID mit einem SIRPα-Polymorphismus, der für die Toleranz von Mausmakrophagen gegenüber menschlichen Zellen verantwortlich ist, aufgrund einer erhöhten Bindung des NOD SIRPα-Allels an das menschliche CD47-Molekül12,13. In den frühen 2000er Jahren war die Deletion der gemeinsamen Gammakette des IL-2-Rezeptors (IL-2Rγc) sowohl auf immundefizienten BALB/c- als auch auf NOD-Stämmen ein Wendepunkt für eine verbesserte menschliche Transplantation, da genetische Deletionen die Entwicklung von Wirts-NK-Zellen verhinderten14,15,16,17. Alternative Modelle, wie BRG- und NRG-Mäuse, erreichen T- und B-Zell-Defizienz durch Deletion des Rag1– oder Rag2-Gens, das für T- und B-Zell-Rezeptor-Genumlagerungen und damit für die Reifung und das Überleben von Lymphozyten erforderlich ist18,19. Die hier verwendete BRGS-Maus (BALB/c-Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) kombiniert die IL-2Rγ-Kettendefizienz und das NOD-SIRPα-Allel auf dem Rag2-/- Hintergrund, was zu einer hochgradig immundefizienten Maus ohne T-, B- oder NK-Zellen führt, jedoch mit ausreichender Vitalität und Gesundheit, um ein langfristiges Transplantat von mehr als 30 Wochen zu ermöglichen13.
HIS-Mäuse können auf verschiedene Arten erzeugt werden, wobei die menschliche PBMC-Injektion die direkteste Methode ist15,18,20. Diese Mäuse weisen jedoch eine ausgeprägte Ausdehnung aktivierter menschlicher T-Zellen auf, die im Alter von 12 Wochen zu einer Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD) führt, was Langzeitstudien verhindert. Alternativ können auch humane hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut (CB), Knochenmark und fetaler Leber für die Transplantation und Produktion des menschlichen Immunsystems de novo verwendet werden. In diesem System produzieren die hämatopoetischen Stammzellen ein menschliches Immunsystem mit mehreren Linien mit der Bildung von T-, B- und angeborenen Immunzellen, die im Vergleich zu den PBMC-Mäusen, die hauptsächlich T-Zellen entwickeln, gegenüber dem Mauswirt sehr tolerant sind. Daher fehlt die GVHD oder ist stark verzögert, und die Studien können auf Mäuse bis zu einem Alter von 10 Monaten ausgeweitet werden. CB bietet eine einfache, zugängliche und nicht-invasive Quelle von CD34+ humanen hämatopoetischen Stammzellen, die die Transplantation mehrerer KIS-Mäuse mit genetisch identischem Immunsystem erleichtert 17,18,20,21. In den letzten Jahren wurden HIS-Mausmodelle ausgiebig zur Untersuchung der Immuntherapie und des TME 3,4,5,6 eingesetzt. Trotz der Entwicklung eines vom Menschen abgeleiteten Immunsystems in diesen Mäusen wachsen menschliche Xenotransplantat-Tumore im Vergleich zu den immundefizienten Kontrollmäusen mit ähnlichen Geschwindigkeiten und ermöglichen das komplexe Zusammenspiel zwischen den Krebszellen und den Immunzellen, das für die Aufrechterhaltung der Mikroumgebung des transplantierten PDX wichtig ist 3,7,8 . Dieses Protokoll wurde verwendet, um über 50 Studien durchzuführen, in denen Behandlungen an HIS-BRGS-Mäusen mit PDXs und CDXs getestet wurden. Eine wichtige Schlussfolgerung ist, dass die humanen Tumore in den HIS-Mäusen ihre einzigartige TME beibehalten, wie sie durch die molekulare Bewertung des Tumors in Bezug auf die ursprüngliche Patientenprobe und die Eigenschaften des Immuninfiltrats definiert wird 3,22,23. Unsere Gruppe konzentriert sich auf die eingehende Evaluierung des KIS sowohl in Immunorganen als auch im Tumor mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Humanisierung von BRGS-Mäusen, die Bewertung von Chimärismus, die Implantation von humanen Tumoren, Tumorwachstumsmessungen, die Verabreichung von Krebsbehandlungen und die Analyse der HIS-Zellen mittels Durchflusszytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten 6 Jahren hat unser Forschungsteam mit unserer Expertise sowohl in der Immunologie als auch an humanisierten Mäusen ein dringend benötigtes präklinisches Modell entwickelt, um Immuntherapien an einer Vielzahl von menschlichen Tumoren zu testen 3,7,30,31. Dieses Protokoll betont die Berücksichtigung der Variabilität des Modells, mit besonderem Augenmerk auf die immuntherapieze…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns sowohl bei der Animal Research Facility (OLAR) für die Betreuung unserer Mäuse als auch bei der Flow Cytometry Shared Resource, die durch den Cancer Center Support Grant (P30CA046934) an unserem Institut unterstützt wird, für ihre immense Hilfe bei all unserer Arbeit. Wir danken auch Gail Eckhardt und Anna Capasso für unsere erste Zusammenarbeit bei der Untersuchung von Immuntherapien gegen humane PDXs in unserem HIS-BRGS-Modell. Diese Studie wurde teilweise durch den National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant unter Verwendung der PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035, unterstützt. Diese Forschung wurde zum Teil vom NIAID der National Institutes of Health unter der Vertragsnummer 75N93020C00058 unterstützt.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
Referenzen
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
