Explorer la stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées
Summary
Ce protocole fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le protocole fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la médecine traditionnelle chinoise (MTC).
Abstract
Compte tenu des avantages de la combinaison de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement de l’ischémie cérébrale, nous avons étudié les différences d’efficacité et de mécanisme entre la combinaison de préparation et la combinaison de composants afin d’explorer la stratégie de combinaison à deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le chlorure de cobalt (CoCl2) combiné à un milieu sans glucose a été utilisé pour induire des dommages oxydatifs des cellules PC12. Ensuite, la combinaison optimale d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) injection a été sélectionnée et combinée selon des méthodes de conception uniformes après criblage de leur concentration sûre et efficace sur les cellules PC12. En outre, la combinaison de composants criblés comprend 10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarine et 75 μM d’acide chlorogénique dans deux herbes. Ensuite, le MTT, l’annexine V-FITC/PI, l’immunofluorescence et l’analyse par transfert Western ont été utilisés pour évaluer l’efficacité et le mécanisme de la combinaison de préparations et de la combinaison de composants sur les cellules PC12 lésées. Les résultats ont montré que la combinaison de préparation optimale pour la survie cellulaire pro-était l’injection d’Ast et la capsule d’Eri avec une concentration de 6: 1,8 (μM). La combinaison de composants (10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique) était plus efficace que la combinaison de préparation. Les deux combinaisons ont remarquablement réduit le taux apoptotique, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 et le niveau intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS); pendant ce temps, ils ont régulé à la hausse les niveaux d’expression de p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax et Nrf2. Ces effets étaient plus évidents dans la combinaison de composants. En conclusion, les deux combinaisons peuvent inhiber la lésion induite par CoCl2 combiné avec un milieu sans glucose sur les cellules PC12, favorisant ainsi la survie cellulaire. Cependant, l’efficacité de la combinaison de composants par rapport à la combinaison de préparation peut être due à sa régulation plus forte de la voie de signalisation PI3K / Akt / Nrf2 liée au stress oxydatif et à l’apoptose.
Introduction
L’ischémie cérébrale chronique, causée par l’hypoperfusion cérébrale, est une maladie fréquente chez les personnes d’âge moyen et les personnes âgées1. En tant que maladie d’ischémie occulte à long terme, elle peut entraîner un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant. Les principaux mécanismes pathologiques comprennent l’apoptose cellulaire et les dommages oxydatifs, conduisant à un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant; c’est la base pathologique de la maladie d’Alzheimer, de la démence vasculaire et d’autres maladies, et affecte gravement la qualité de vie des patients. Cependant, il y a encore un manque de médicaments idéaux dans la médecine moderne pour traiter l’ischémie cérébrale chronique2. Dans le même temps, la combinaison d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) a été largement utilisée dans la pratique clinique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC)4. La stratégie de combinaison s’est remarquablement améliorée pour favoriser la récupération de la fonction nerveuse après une ischémie cérébrale, ce qui est meilleur que celui d’un seul médicament; Cependant, il existe de grandes différences dans le rapport posologique dans la combinaison des deux médicaments4. Les composants efficaces et le mécanisme d’action ne sont pas bien définis, ce qui est la question clé limitant son application clinique.
Des études antérieures ont démontré l’effet synergique de la combinaison de préparation d’Ast injection et d’Eri injection dans le traitement de l’ischémie cérébrale chez le rat. Il peut réguler positivement l’expression de la protéine p-Akt et réguler à la baisse l’expression dela protéine 5,6 promotrice de la mort associée à Bcl-2 (BAD), qui est l’une des protéines de la famille B-lymphoblastome 2 (Bcl-2) et a pour effet de favoriser l’apoptose. Cependant, la base matérielle et le mécanisme de son effet synergique ne sont pas clairs. En outre, le modèle de lésion des cellules PC12 a été établi avec un milieu sans glucose combiné CoCl2, et la combinaison optimale de composants dans Ast et Eri a été examinée et définie7.
Dans cette étude, les doses efficaces d’Ast et d’Eri sont examinées à l’aide du modèle de cellules PC12 blessées. La combinaison optimale des deux médicaments est examinée à l’aide de ce modèle combiné à la méthode de conception homogène. Le modèle cellulaire est utilisé pour évaluer davantage la différence dans les effets et les mécanismes de la combinaison de préparation et de la combinaison de composants dans les cellules PC12 lésées. Cette stratégie vise à explorer l’effet protecteur et le mécanisme de régulation des deux types de combinaisons sur les cellules PC12 lésées par la voie du signal PI3K / Akt / Nrf2 afin de déterminer le meilleur mode de combinaison. Cette étude fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la MTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a encore un manque de médicaments idéaux pour le traitement de l’ischémie cérébrale dans la pratique clinique moderne2. Sous la direction de la supplémentation en qi et de l’activation de la méthode de circulation sanguine, Ast, Eri et d’autres préparations ont été utilisés en combinaison dans la pratique clinique de la MTC et ont obtenu de bons avantages complets13,14,15. Un grand n…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par des projets clés de R & D du Département provincial de la science et de la technologie du Sichuan (2020YFS0325).
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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