ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi
Summary
Membran temas bölgelerini (MCS’ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS’lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Membran temas bölgeleri (MCS’ler), membran füzyonunu içermeden yan yana getirilmiş organeller arasında çeşitli biyomoleküllerin (yani kalsiyum ve lipitler) dinamik değişimine izin veren ve düzenleyen yakın membran yakınlığı alanlarıdır. MCS’ler hücresel homeostaz için gereklidir ve işlevleri, genellikle multimerik protein kompleksleri olarak bulunan yerleşik bileşenler tarafından sağlanır. MCS’ler genellikle lipid sentezi ve hücresel kalsiyum depolamanın önemli bir bölgesi olan endoplazmik retikulumu (ER) içerir ve klasik veziküler taşıma yollarından dışlanan mitokondri gibi organeller için özellikle önemlidir. Son yıllarda, ER ve mitokondri arasındaki MCS’ler, işlevleri hücresel metabolizmayı/biyoenerjetik değerleri güçlü bir şekilde etkilediği için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu temas bölgelerinde membran bağları, kalsiyum kanalları ve lipid transfer proteinleri dahil olmak üzere çeşitli proteinler tanımlanmaya başlanmıştır, bu nedenle bu MCS bileşenlerini incelemek için yeni metodolojilere ve teknik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır. Burada, birbirine fiziksel olarak yakın (>40 nm) olan ve ER-mitokondri MCS’lerinde aynı zarda bulunan proteinlerin saptanmasına izin veren, yakınlık ligasyon testi (PLA), mitokondri boyama ve 3D görüntüleme segmentasyonunu içeren birleşik teknik yaklaşımlardan oluşan bir protokolü açıklıyoruz. Örneğin, daha önce ER-mitokondri ve ER-plazma membranı MCS’lerinde etkileşime girdiği ve lokalize olduğu gösterilen iki ER’ye bağlı lipid transfer proteini, ORP5 ve ORP8 kullandık. ORP5-ORP8 PLA’yı hücre görüntüleme yazılımı analizi ile ilişkilendirerek, ORP5-ORP8 kompleksinin mitokondriyal yüzeyden uzaklığını tahmin etmek ve ORP5-ORP8 PLA etkileşiminin yaklaşık% 50’sinin mitokondriye yakın ER alt alanlarında meydana geldiğini belirlemek mümkün olmuştur.
Introduction
Organeller arası iletişim, ökaryotik hücrelerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Organellerin iletişim kurmasının bir yolu, bağlar, lipid transfer proteinleri ve kalsiyum kanalları gibi yapısal ve fonksiyonel proteinler tarafından korunan iki organel arasındaki yakın zar karşıtlıkları olan zar temas bölgeleri (MCS’ler) oluşturmaktır1. MCS’ler benzer veya farklı organeller arasında kurulabilir ve hücresel homeostazı korumak için önemli olan hücresel bileşenlerin değişimine aracılık ederler. Bugüne kadar, endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri, ER-plazma membranı (PM) ve ER-lipid damlacık (LD) kontakları1 dahil olmak üzere çeşitli MCS tanımlanmıştır. Bunlar arasında, ER ve mitokondri (MERCS’ler) arasında oluşanlar, lipid ve kalsiyum homeostazı2 dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynadıkları için en çok çalışılanlar arasındadır. Mitokondri, klasik veziküler taşıma yollarından büyük ölçüde dışlandığından, ER’den anahtar lipitleri veya lipid öncüllerini ithal etmek için MERCS’ye ve moleküler bileşenlerine güvenirler. Bu lipitlerin MERCS’ler arasında veziküler olmayan taşınması, uygun mitokondriyal lipid bileşiminin yanı sıra fonksiyonel ve yapısal bütünlüklerinin korunmasını sağlar3.
MCS’lerin çeşitli hücresel fonksiyonlara önemli katılımı göz önüne alındığında, moleküler bileşenlerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına olan ilgi son yıllarda büyük ölçüde artmıştır. MCS’ler hakkındaki bilgileri ilerletmek için çeşitli görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bunlar arasında, floresan prob tabanlı yakınlık ligasyon testi (PLA), endojen seviyelerdeorganeller arası protein-protein etkileşimlerini (40 nm’lik bir tespit aralığında) tespit ederek MCS’lerin bolluğunun bir göstergesi olarak yaygın olarak kullanılmıştır 4. Örneğin, MERCS’ler, VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 ve PTPIP51-VAPB 5,6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli mitokondri-ER protein çiftleri arasında PLA kullanılarak görselleştirildi ve ölçüldü. Bu teknoloji, MCS 5,7,9,10,11’de bulunan organeller arası protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılmış olsa da, çalışmaların çoğu PLA’yı organel boyama ile birleştirmemiştir. Sonuç olarak, PLA etkileşimleri ve ilişkili organeller arasındaki yakınlığın ölçülmesine izin veren nicel bir yöntem henüz geliştirilmemiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, ER proteinleri söz konusu olduğunda, diğer organellerle temas halinde olan zar alt alanları içindeki etkileşimleri, yaygın olarak dağılmış ER ağı içindeki etkileşimlerinden ayırt edilmemiştir.
Burada, aynı organelin zarında bulunan proteinler arasındaki PLA etkileşimlerini tespit etmek ve bunların MCS’deki ortak organelin zarına yakınlığını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol iki öncül temelinde geliştirilmiştir: 1) aşırı ekspresyon koşullarında, ER lipid transfer proteinleri ORP5 ve ORP8’in ER-mitokondri ve ER-PM MCS’lerde 12,13,14,15 birlikte lokalize olduğunu ve etkileşime girdiğini ve ORP5’in ER-LD temaslarındalokalize olduğunu gösteren önceki çalışmalar 16,17; 2) PLA, konfokal mikroskopi, organel etiketleme ve 3D görüntüleme analizi dahil olmak üzere mevcut teknolojiler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, MCS’lerde, özellikle MERCS’lerde organeller arası protein PLA etkileşimlerini tanımlamak ve ölçmek için tasarlanmıştır. Protokolün yeniliği, aynı zarda bulunan iki protein arasındaki PLA etkileşimlerini lokalize etmek ve ölçmek için PLA’yı çoklu organellerin etiketlenmesi, konfokal mikroskopi ve 3D görüntü analizi ile birleştirmesidir, bu durumda ER zarı içinde mitokondri zarı (MAM) veya MAM ve LD’ler ile aynı anda. Bu protokol, belirli MERCS’lerde ve aynı zamanda diğer MCS’lerd…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir Programı, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) ve Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Bitki Bilimleri).
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
Referenzen
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
