Nous décrivons une méthode pour séparer efficacement l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de la rétine dans les yeux humains et générer des supports plats RPE / choroïdes entiers pour les analyses histologiques et morphométriques de l’EPR.
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la rétine sont des tissus fonctionnellement et structurellement connectés qui travaillent ensemble pour réguler la perception de la lumière et la vision. Les protéines de la surface apicale de l’EPR sont étroitement associées aux protéines de la surface du segment externe du photorécepteur, ce qui rend difficile la séparation cohérente de l’EPR des photorécepteurs/rétine. Nous avons développé une méthode pour séparer efficacement la rétine de l’EPR des yeux humains afin de générer des supports plats complets de l’EPR/choroïde et de la rétine pour une analyse cellulaire séparée des photorécepteurs et des cellules EPR. Une injection intravitréenne d’une solution à haute osmolarité de D-mannitol, un sucre non transporté par l’EPR, a induit la séparation de l’EPR et de la rétine sur toute la chambre postérieure sans endommager les jonctions cellulaires de l’EPR. Aucun patch EPR n’a été observé attaché à la rétine. Le marquage de l’actine à la phalloïdine a montré la préservation de la forme de l’EPR et a permis une analyse morphométrique de l’épithélium entier. Un logiciel basé sur l’intelligence artificielle (IA) a été développé pour reconnaître et segmenter avec précision les frontières cellulaires RPE et quantifier 30 mesures de forme différentes. Cette méthode de dissection est hautement reproductible et peut être facilement étendue à d’autres modèles animaux.
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la rétine neurale sont fortement interconnectés l’un avec l’autre en raison de la forte dépendance physiologique des photorécepteurs à l’EPR. Pendant la dissection, la séparation mécanique de la rétine neurale de l’EPR provoque la déchirure des cellules EPR, les parties apicales de l’EPR restant attachées aux segments externes des photorécepteurs rétiniens. L’étendue de l’adhérence RPE-rétinienne est si grande que la quantité de pigment restant sur la rétine après la séparation est utilisée pour quantifier la force de l’adhérence rétinienne1. Plus précisément, les jonctions serrées RPE et la structure d’actine qui les relie, qui sont situées du côté apical, se rompent lors de la séparation mécanique. Par conséquent, la coloration des supports plats RPE pour les bordures de cellule entraîne une monocouche inégale dans laquelle de nombreuses cellules ont des bordures manquantes. Cet effet est exacerbé lorsque le tissu est fixé avec du paraformaldéhyde (PFA) avant la dissection, car les protéines deviennent réticulées.
Des études sur l’administration intravitréenne de médicaments ont montré que les injections de solutions hyperosmotiques dans la chambre postérieure induisent un décollement de la rétine 2,3. Dans ces expériences, 50 μL de solutions différentes, allant de 1 000 mOsm à 2 400 mOsm, injectés dans le vitré moyen ont provoqué un décollement de la rétine en quelques minutes. Notamment, même après de longues expositions à des solutions à haute osmolarité, les jonctions serrées RPE sont apparues intactes dans les images microscopiques électroniques de transmission des yeux de lapin et de singe3. Suivant une stratégie similaire, nous avons injecté dans le vitré moyen une solution hyperosmotique de D-mannitol pour induire un décollement de la rétine efficace avant d’effectuer une dissection RPE. Comme le D-mannitol n’est pas transporté par l’EPR4, une concentration intravitréenne élevée est maintenue, générant un gradient osmotique. La séparation efficace de l’EPR et de la rétine sur toute la chambre postérieure garantit la préservation des jonctions cellulaires de l’EPR et permet l’étude de la morphométrie de l’EPR sur l’ensemble du support plat. En outre, nous avons développé un logiciel basé sur l’intelligence artificielle (IA) qui reconnaît et segmente les bordures de cellules RPE marquées par fluorescence, quantifie 30 métriques de forme différentes et produit des cartes thermiques de chaque métrique pour la visualisation 5,6.
La séparation cohérente et efficace de l’EPR humaine et des rétines peut être réalisée à l’aide de ce protocole. Cette méthode permet d’étudier les différences régionales de forme de l’EPR sur l’ensemble de la rétine humaine5. Une étape cruciale du protocole est la séparation physique de l’EPR et de la rétine. Si les deux tissus ne sont pas complètement détachés dans certaines zones, il faut soulever doucement la rétine, en veillant à ne pas casser les tissus. L’analyse REShAPE de grands supports plats peut nécessiter l’utilisation de systèmes dotés de ressources RAM considérables. Dans ce cas, le réassemblage de l’image entière peut être désactivé pour permettre au logiciel de terminer l’analyse avec succès malgré un manque de ressources de traitement.
La principale limitation de l’utilisation de REShAPE pour segmenter les montages plats humains en EPR est que l’algorithme d’IA a été principalement formé sur des images d’EPR induites dérivées de cellules souches pluripotentes. En conséquence, la segmentation des supports plats RPE humains est moins précise. Les cellules EPR de donneurs âgés contiennent une grande quantité de lipofuscine7, et le large spectre de son autofluorescence interfère avec la segmentation des frontières cellulaires. À l’avenir, davantage d’images de montages plats RPE seront utilisées pour améliorer la segmentation des frontières cellulaires dans ce type d’échantillon. Malgré cette limitation, REShAPE a été spécialement formé pour reconnaître et segmenter les frontières des cellules RPE et fonctionne mieux que d’autres méthodes existantes, telles que la segmentation Voronoi8 et CellProfiler9 des cellules RPE.
De plus, par rapport à la segmentation manuelle 10, REShAPE offre l’avantage d’analyser rapidement les grandes images (~130 000 pixels x130 000 pixels ont été testés). En conclusion, cette méthode de dissection est hautement reproductible et peut être facilement étendue à d’autres modèles animaux. En outre, le logiciel peut être utilisé pour étudier la forme de l’EPR dans des montures plates oculaires ou dans des modèles de culture cellulaire pour examiner l’effet de certains traitements. Enfin, la polyvalence de REShAPE le rend largement applicable à l’analyse d’autres types de cellules épithéliales.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le noyau d’histologie du National Eye Institute (NEI) pour l’utilisation du Zeiss Axio Scan.Z1. Nous remercions également les donateurs, leurs familles, le Réseau Advancing Sight et le Lions Eye Institute pour leur générosité. Ce travail a été financé par les fonds du PRI NEI (numéro de subvention ZIA EY000533-04).
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |