Interrogation par appariement spécifique à la cellule de l’épigénome ovarien et du transcriptome de la souris
Summary
Dans ce protocole, la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et la méthode d’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été optimisées pour l’interrogation par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide du modèle murin NuTRAP croisé vers une lignée de souris Cyp17a1-Cre.
Abstract
L’évaluation des changements épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type cellulaire est essentielle pour comprendre le vieillissement ovarien. À cette fin, l’optimisation de la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été réalisées pour l’interrogation ultérieure par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide d’un nouveau modèle murin NuTRAP transgénique. L’expression de l’allèle NuTRAP est sous le contrôle d’une cassette STOP floxed et peut être ciblée sur des types spécifiques de cellules ovariennes à l’aide de lignées Cre spécifiques au promoteur. Étant donné que des études récentes ont impliqué les cellules stromales ovariennes dans la conduite des phénotypes de vieillissement prématuré, le système d’expression NuTRAP a ciblé les cellules stromales à l’aide d’un pilote Cyp17a1-Cre. L’induction de la construction NuTRAP était spécifique aux fibroblastes stromaux ovariens, et suffisamment d’ADN et d’ARN pour les études de séquençage ont été obtenus à partir d’un seul ovaire. Le modèle NuTRAP et les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour étudier n’importe quel type de cellule ovarienne avec une lignée Cre disponible.
Introduction
Les ovaires sont des acteurs majeurs du vieillissement somatique1, avec des contributions distinctes de populations cellulaires spécifiques. L’hétérogénéité cellulaire de l’ovaire rend difficile l’interprétation des résultats moléculaires des tests en vrac sur des ovaires entiers. Comprendre le rôle de populations cellulaires spécifiques dans le vieillissement ovarien est essentiel pour identifier les facteurs moléculaires responsables du déclin de la fertilité et de la santé chez les femmes âgées. Traditionnellement, l’évaluation multi-omique de types spécifiques de cellules ovariennes était réalisée par des techniques telles que la microdissection laser2, les approches unicellulaires3 ou le tri cellulaire4. Cependant, la microdissection peut être coûteuse et difficile à réaliser, et le tri cellulaire peut modifier les profils phénotypiquescellulaires 5.
Une nouvelle approche pour évaluer les profils épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type de cellules ovariennes utilise le modèle murin NuTRAP (Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purity). Le modèle NuTRAP permet d’isoler des acides nucléiques spécifiques au type cellulaire sans avoir besoin de trier les cellules en utilisant les méthodes de purification par affinité : purification d’affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT)6. L’expression de l’allèle NuTRAP est sous le contrôle d’une cassette STOP floxed et peut être ciblée sur des types spécifiques de cellules ovariennes à l’aide de lignées Cre spécifiques au promoteur. En croisant la souris NuTRAP avec une lignée Cre spécifique au type cellulaire, le retrait de la cassette STOP provoque le marquage eGFP du complexe ribosomique et le marquage biotine/mCherry du noyau d’une manière Cre-dépendante6. Les techniques TRAP et INTACT peuvent ensuite être utilisées pour isoler l’ARNm et l’ADN nucléaire du type cellulaire d’intérêt et procéder à des analyses transcriptomiques et épigénomiques.
Le modèle NuTRAP a été utilisé dans différents tissus, tels que le tissu adipeux6, le tissu cérébral 7,8,9 et la rétine10, pour révéler des changements épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type cellulaire qui peuvent ne pas être détectés dans l’homogénat de tissu entier. Les avantages de l’approche NuTRAP par rapport aux techniques traditionnelles de tri cellulaire comprennent : 1) la prévention des artefacts d’activation ex vivo 8, 2) le besoin réduit d’équipement spécialisé (c.-à-d. trieurs de cellules) et 3) l’augmentation du débit et la diminution du coût des analyses spécifiques au type de cellule. En outre, la capacité d’isoler l’ADN et l’ARN spécifiques au type cellulaire d’une seule souris permet des analyses appariées qui augmentent la puissance statistique. Étant donné que des études récentes ont impliqué les cellules stromales ovariennes dans la conduite prématurée des phénotypes de vieillissement 11,12,13, nous avons ciblé le système d’expression NuTRAP sur les cellules stromales et thèques à l’aide d’un pilote Cyp17a1-Cre. Ici, nous démontrons que l’induction de la construction NuTRAP est spécifique aux cellules stromales ovariennes et thèques, et que suffisamment d’ADN et d’ARN pour les études de séquençage sont obtenus à partir d’un seul ovaire. Le modèle NuTRAP et les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour étudier n’importe quel type de cellule ovarienne avec n’importe quelle lignée Cre disponible.
Pour la génération d’une lignée de souris NuTRAP ovarienne spécifique au type cellulaire, l’allèle NuTRAP (Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purity) a un codon STOP floxed qui contrôle l’expression de BirA, du peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP) marqué mCherry/mRANGAP1 et eGFP/L10a. Lorsqu’elle est croisée avec une lignée Cre spécifique au type cellulaire, l’expression de la cassette NuTRAP marque la protéine nucléaire mRANGAP1 avec de la biotine/mCherry et la protéine ribosomique L10a avec eGFP d’une manière Cre-dépendante. Cela permet d’isoler les noyaux et les ARNm de types cellulaires spécifiques sans avoir besoin de tri cellulaire. Le flox/flox NuTRAP peut être jumelé à un Cre spécifique au type cellulaire pertinent pour les types de cellules ovariennes pour évaluer cela.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle murin NuTRAP6 est une puissante approche de marquage transgénique pour l’interrogation par appariement du transcriptome et de l’épigénome à partir de types cellulaires spécifiques qui peuvent être adaptés à n’importe quel type de cellule avec un pilote Cre disponible. Ici, nous démontrons la spécificité du modèle murin Cyp17-NuTRAP dans le ciblage des cellules ovariennes thèques et stromales. Le modèle Cyp17-NuTRAP peut être utilisé pour élucider davantage les mé…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), de la Fondation BrightFocus (M2020207) et de la Presbyterian Health Foundation. Ce travail a également été soutenu en partie par le prix MERIT I01BX003906 et un prix du Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 des États-Unis (É.-U.) Ministère des Anciens Combattants, Service de recherche et de développement en laboratoire biomédical. Les auteurs aimeraient également remercier le Clinical Genomics Center (OMRF) et l’Imaging Core Facility (OMRF) pour leur aide et leur utilisation des instruments.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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