JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

רישום זרם אשלגן תלוי מתח על קרדיומיוציטים H9C2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה יעילה לרכישה דינמית בזמן אמת של זרמי תעלה אשלגן מגודר מתח (Kv) בקרדיומיוציטים H9c2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים.

Abstract

תעלות אשלגן על קרום תא שריר הלב ממלאות תפקיד חשוב בוויסות הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא. בהיותו אחד מתעלות היונים העיקריות, תעלות אשלגן מגודרות מתח (Kv) קשורות קשר הדוק לכמה מחלות לב חמורות, כגון נזק לשריר הלב הנגרם על ידי תרופות ואוטם שריר הלב. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לקבוע את ההשפעות של 1.5 mM 4-aminopyridine (4-AP, מעכב תעלות אשלגן רחב טווח) ואקוניטין (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM ו- 200 μM) על זרם ערוץ Kv (I Kv) בקרדיומיוציטים H9c2. נמצא כי 4-AP עיכב את ה-I Kv בכ-54%, בעוד שההשפעה המעכבת של AC עלה-I Kv הראתה מגמה תלוית מינון (ללא השפעה עבור 25 μM, שיעור מעכב של 30% עבור 50 μM, שיעור מעכב של 46% עבור 100 μM ושיעור מעכב של 54% עבור 200 μM). בשל המאפיינים של רגישות ודיוק גבוהים יותר, טכניקה זו תקדם את חקר הקרדיוטוקסיות ואת ההשפעות הפרמקולוגיות של אתנו-רפואה המכוונות לתעלות יונים.

Introduction

תעלות יונים הן חלבונים משולבים מיוחדים המוטבעים בדו-שכבת השומנים של קרום התא. בנוכחות אקטיבטורים, המרכזים של חלבונים משולבים מיוחדים כאלה יוצרים נקבוביות הידרופיליות סלקטיביות ביותר, המאפשרות ליונים בגודל ומטען מתאימים לעבור באופן הובלה פסיבי1. תעלות יונים הן הבסיס לרגישות התאים ולביו-אלקטריות וממלאות תפקיד מפתח במגוון פעילויות תאיות2. הלב מספק דם לאיברים אחרים באמצעות התכווצויות קבועות הנובעות מתהליך עירור-כיווץ-מצומד היזום על ידי פוטנציאל פעולה3. מחקרים קודמים אישרו כי הדור של פוטנציאל הפעולה בקרדיומיוציטים נגרם על ידי השינוי בריכוז היונים התוך-תאיים, וההפעלה וההשבתה של תעלות יונים Na+, Ca2+, ו-K+ בקרדיומיוציטים אנושיים מובילות להיווצרות פוטנציאלי פעולה ברצף מסוים 4,5,6. זרמי תעלה של אשלגן מגודר מתח (Kv) (IKv) עלולים לשנות את קצב הלב הרגיל, ולהוביל להפרעות קצב, שהן אחת הסיבות המובילות למוות. לכן, הקלטתה-I Kv היא קריטית להבנת המנגנונים של תרופות לטיפול בהפרעות קצב מסכנות חיים7.

תעלת Kv היא מרכיב חשוב בתעלת האשלגן. פונקציית הקואורדינציה של תעלת Kv ממלאת תפקיד חשוב בפעילות החשמלית ובהתכווצות שריר הלב של לב היונקים 8,9,10. בקרדיומיוציטים, המשרעת ומשך פוטנציאל הפעולה תלויים בהולכה משותפת של זרמי K+ חיצוניים על ידי תת-סוגים מרובים של ערוץ Kv11. הרגולציה של פונקציית ערוץ Kv חשובה מאוד עבור repolarization נורמלי של פוטנציאל הפעולה הלב. אפילו השינוי הקל ביותר במוליכות Kv משפיע מאוד על רה-פולריזציה של הלב ומגדיל את האפשרות להפרעות קצב12,13.

כמייצגת שיטה בסיסית במחקר אלקטרופיזיולוגי תאי, ניתן ליצור חותם בעל עמידות גבוהה בין אזור קטן של קרום התא לבין קצה פיפטה לרישום מהדק טלאי של תא שלם על ידי הפעלת לחץ שלילי. הלחץ השלילי המתמשך גורם לקרום התא לבוא במגע עם קצה הפיפטה ולהידבק לדופן הפנימית של הפיפטה. המעגל החשמלי השלם המתקבל מאפשר להקליט כל זרם של תעלת יונים בודדת על פני השטח של קרום התא14. לטכניקה זו רגישות גבוהה מאוד לזרם תעלת היונים של קרום התא וניתן להשתמש בה לאיתור זרמים בכל תעלות היונים, והיישומים רחבים ביותר15. יתר על כן, בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי ותיוג רדיואקטיבי, למהדק טלאי יש סמכות ודיוק גבוהים יותר16. נכון לעכשיו, נעשה שימוש בטכניקת הידוק המדבקות של תאים שלמים כדי לזהות את רכיבי הרפואה הסינית המסורתית הפועלים על זרמי ערוץ Kv17,18,19. לדוגמה, Wang et al. השתמשו בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים ואישרו כי הרכיב היעיל של זרע הלוטוס עשוי להשיג את העיכוב של ערוץ Kv4.3 על ידי חסימת ערוצי המדינה המופעלים19. אקוניטין (AC) הוא אחד המרכיבים היעילים והפעילים של מיני אקוניטום, כגון אקוניטום קרמיכאלי דבקס ואקוניטום מטוטלת בוש. מחקרים רבים הראו כי מנת יתר של AC יכול לגרום הפרעות קצב ואפילו דום לב20. האינטראקציה בין AC לתעלות יונים מגודרות מתח מובילה לשיבוש של הומאוסטזיס יונים תוך תאי, שהוא מנגנון המפתח של קרדיוטוקסיות21. לכן, במחקר זה, טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים משמשת לקביעת ההשפעות של AC עלI Kv של קרדיומיוציטים.

Protocol

הקרדיומיוציטים של חולדות H9c2 שהתקבלו באופן מסחרי (ראו טבלת החומרים) דוגרו ב-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת חום (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2. לאחר מכן, נעשה שימוש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לזהות את השינוייםב-I Kv …

Representative Results

פרוטוקול זה איפשר הקלטה שלI Kv על פי הפרמטרים שנקבעו בטכניקת תיקון תא שלם. ה-I Kv הופעל על-ידי 150 מילישניות של גירוי דופק דה-פולריזציה מ-40+ עד +60 mV בפוטנציאל החזקה של −60 mV (איור 3A). ה-I Kv של קרדיומיוציטים של חולדות H9c2 הופיע לראשונה בסביבות −20 mV, ואז המשרעת גדלה עם ד…

Discussion

הטכניקה האלקטרופיזיולוגית של מהדק טלאי משמשת בעיקר לתיעוד ושיקוף הפעילות החשמלית והמאפיינים התפקודיים של תעלות יונים על קרום התא25. כיום, שיטות ההקלטה העיקריות של טכניקת מהדק הטלאי כוללות הקלטה חד-ערוצית והקלטת תאים שלמים26. עבור מצב התא כולו, מיקרואלקטרודת הזכו?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130113) ומתוכנית המו”פ והטרנספורמציה המרכזית של מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז צ’ינגהאי (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/de/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image