Демонстрация анализа ДНК-волокна для исследования повреждений ДНК и динамики репарации, индуцированной наночастицами

Summary

Методология помогает в анализе вариаций динамики репликации ДНК в присутствии наночастиц. Различные методологии могут быть приняты в зависимости от уровня цитотоксичности интересующего материала. Кроме того, предоставляется описание анализа изображений, чтобы помочь в анализе волокон ДНК.

Abstract

Воздействие наноматериала может вызвать репликационный стресс и геномную нестабильность в клетках. Степень нестабильности зависит от химического состава, размера и концентрации наноматериалов, времени воздействия и типа подвергшихся воздействию клеток. Несколько установленных методов были использованы для выяснения того, как эндогенные/экзогенные агенты влияют на глобальную репликацию. Тем не менее, анализы на уровне репликонов, такие как анализ ДНК-волокна, необходимы для понимания того, как эти агенты влияют на инициацию, прекращение и прогрессирование репликационной вилки. Знание этого позволяет лучше понять, как наноматериалы увеличивают шансы на фиксацию мутаций и геномную нестабильность. Мы использовали макрофаги RAW 264.7 в качестве модельных клеток для изучения динамики репликации под воздействием наночастиц оксида графена. Здесь мы демонстрируем базовый протокол анализа ДНК-волокна, который включает в себя импульсную маркировку нуклеотидными аналогами, лизис клеток, распространение меченных импульсом волокон ДНК на предметные стекла, флуоресцентное иммуноокрашивание нуклеотидных аналогов в волокнах ДНК, визуализацию репликационных промежуточных продуктов в волокнах ДНК с использованием конфокальной микроскопии и промежуточный анализ репликации с использованием программного обеспечения для компьютерной оценки и анализа (CASA).

Introduction

Во время каждого клеточного цикла репликация ДНК обеспечивает точную дупликацию^{генома 1}. Эукариотическая хромосомная репликация по существу зависит от трех факторов: времени запуска нескольких источников репликации, скорости разветвлений, возникающих из запущенных источников, и завершения процесса репликации, когда встречаются две репликационные вилки из соседних источников². Для высокоточной передачи генетической информации дочерним клеткам, а также для сохранения генетической целостности точная репликация ДНК имеет решающее значение. Агенты, которые развиваются в результате регулярного метаболизма или из-за искусственных или естественных материалов окружающей среды, постоянно атакуют геном. Эти эндогенные и экзогенные агенты заставляют репликационные вилки замедляться или останавливаться из-за столкновения с повреждением ДНК, вызванным этими агентами, и вилки, временно замедляющиеся или останавливающиеся в ответ на эти трудности, называются репликационным стрессом³. В ответ на репликационный стресс клетки разработали несколько молекулярных путей, которые поддерживают стабильность нарушенных репликационных вилок и позволяют им перезапуститься⁴. С точки зрения генетической стабильности, выживаемости клеток и болезней человека эти механизмы реакции на репликацию на стресс стали ключевыми факторами для поддержания здорового генома, обеспечения выживания клеток и снижения вероятности образования заболевания⁵.

Одним из экзогенных агентов, способных вызывать репликационный стресс, являются наночастицы. Наночастицы — это частицы размером от 1 нм до 100^нм6. Благодаря большой площади поверхности, отличительным формам и уникальным химическим свойствам наночастицы используются в различных медицинских, фармацевтических, экологических и промышленных применениях ^7,8. Хотя наночастицы имеют много потенциальных преимуществ, некоторые из них (из-за их унаследованной природы или долговечности) могут стать токсичными. Наночастицы также могут образовываться из-за естественного износа медицинских имплантатов и высвобождаться в перипротезную область ^9,10.

Из-за воздействия на людей множества наночастиц, производимых для различных применений, исследования в области токсичности наночастиц значительно возросли за последние 10 лет¹¹. Несмотря на то, что эти исследовательские усилия выявили множество информации о потенциальной угрозе, которую наночастицы представляют для здоровья человека, знания о том, что наночастицы могут вызывать генотоксичность, все еще ограничены. До сих пор было обнаружено, что эти наночастицы могут физически взаимодействовать с ДНК, способствовать повреждению ДНК и повреждать или мешать белкам, ответственным за восстановление или репликацию ДНК¹². Чтобы определить, как они влияют на репликацию ДНК, обычно используют расчесывание ДНК-волокон, радиорезистентный синтез ДНК (RDS) и анализ ДНК-волокон^13,14,15,16.

Метод расчесывания ДНК-волокон является гибким и дает информацию о динамике репликационной вилки на уровне одной молекулы¹⁷. По сути, засоленное покровное стекло осторожно извлекается из раствора ДНК, как только концы ДНК связываются с ним. Молекулы ДНК выпрямляются и выравниваются мениском раствора. Однородность, расстояние и выравнивание волокон ДНК поддерживают точные и надежные измерения длины волоконного тракта. Регулируя продолжительность и последовательность процедур и лекарств, используемых для вызова стресса или повреждения, с помощью этого приложения можно контролировать многие аспекты продвижения вилки. В этом методе используется система двойной маркировки, с помощью которой оценивается скорость и прогрессия репликационной вилки^17,18. С другой стороны, 2D-гель-электрофорез использует тот факт, что при электрофорезе в агарозном геле ветвящиеся структуры ДНК движутся медленнее, чем линейные молекулы ДНК той же массы, что позволяет полностью разделить их в 2D-прогоне. Фактически, этот метод исследуется для разделения молекул ДНК на основе их массы в первом прогоне и на основе их формы во втором ортогональном прогоне. После фрагментации геномной ДНК необычные промежуточные продукты репликации и рекомбинации развивают ветвящуюся форму, и их можно отличить от более распространенных линейных молекул в 2D-геле¹⁹.

Метод RDS используется для определения того, как это влияет на глобальный синтез ДНК. В этом методе степень ингибирования глобальной репликации определяют путем сравнения количества включенных радиоактивно меченных нуклеотидов, таких как [14C]тимидин, в необработанных клетках и обработанных^{клетках 14,20}. Процентная разница в радиоактивной мечке между необработанными и обработанными клетками представляет собой степень, в которой повреждающий ДНК агент влияет на синтез ДНК. Подобно этому, другой метод использует способность клеток интегрировать нуклеотидные аналоги, такие как BrdU (5-бром-2′-дезоксиуридин) для проточной цитометрии для измерения общих скоростей синтеза ДНК^21,22. Хотя эти методы демонстрируют, как агенты, повреждающие ДНК, влияют на глобальный синтез ДНК, они не показывают, как это влияет на отдельные репликоны. Действительно, анализы на уровне репликонов необходимы для лучшего понимания инициации и степени геномной нестабильности в случае воздействия токсичных частиц (наноматериалов). Авторадиография ДНК-волокна и электронная микроскопия – вот некоторые методы, используемые для определения этого^23,24,25,26.

Концепции репликационных пузырьков и двунаправленной репликации из неравномерно расположенных источников были впервые разработаны с использованием одномолекулярных тестов, таких как электронная микроскопия и авторадиография ДНК-волокна^27,28. Прямое наблюдение ветвящихся репликационных промежуточных продуктов на конкретных молекулах, диспергированных по сетке с углеродным покрытием, значительно облегчается электронной микроскопией. Этот метод, который до сих пор используется для отслеживания патологических сдвигов в репликационных вилках, был использован для определения первого эукариотического происхождения репликации ДНК²⁸. Волоконная авторадиография сосредоточена вокруг концепции авторадиографической идентификации вновь реплицированных участков и импульсного мечения хромосом тритированным тимидином. Первая количественная оценка плотности происхождения и скорости репликационных вилок в геномных последовательностях многоклеточных стало возможным благодаря авторадиографии ДНК-волокна²⁹.

В настоящее время методы волоконной флюорографии заняли место ауторадиографии, главным образом потому, что волоконная флюорография намного быстрее, чем авторентгенография. При волоконной флюорографии два галогенированных производных нуклеотидов, такие как бром- (Br), хлор- (Cl) или йоддезоксиуридин (IdU), последовательно включаются в свежереплицированную ДНК, а затем идентифицируются путем непрямой иммунофлюоресценции с использованием антител³⁰. Микроскопическое наблюдение зарождающейся ДНК, которая включает один или оба аналога, стало возможным благодаря иммуноокрашиванию одного из аналогов в один цвет, а другого аналога в другой цвет (например, иммуноокрашивание зарождающейся ДНК с включенным красным IdU и включенным зеленым CldU) (рис. 1)²¹. Многие различные типы репликационных промежуточных продуктов могут быть идентифицированы с помощью анализа волокон ДНК. Наиболее часто изучаются отдельные удлиняющиеся вилки, инициации и окончания. Отдельные удлиняющиеся вилки имеют узор репликации красного цвета, за которым следует зеленый (красно-зеленый; Рисунок 2А). ¹³ Длины этих промежуточных продуктов часто используются для измерения скорости вилки (т.е. длины вилки/времени импульса) или экзонуклеолитической деградации зарождающейся ДНК за счет укорочения трека (рис. 2E)^30,31,32. В исследовании, проведенном Mimitou et al., было обнаружено, что при длительном воздействии гидроксимочевины, репликационного яда, вызывающего двухцепочечные разрывы в ДНК, RE11 был набран³³. MRE11 представляет собой экзонуклеазу, известную своей экзонуклеазной активностью 3′-5′, и она способна разрезать концы ДНК для репарации. Следовательно, при воздействии токсических агентов можно наблюдать экзонуклеолитическую деградацию зарождающейся ДНК, которая представляет собой укорочение цепи ДНК из-за воздействия повреждающего ДНК агента³⁴.

Разрывы репликационной вилки, вызванные физическими препятствиями (ДНК-белковые комплексы или повреждения ДНК), химическими препятствиями или мутациями, могут остановить репликацию и потребовать гомологичной рекомбинации для ее возобновления. Это известно как нарушение прогрессирования вилки. Многочисленные исследования in vitro и in vivo показали, что транскрипция может иногда предотвращать развитие репликационной вилки таким образом³⁵.

Инициации – это источники репликации, которые инициируются и срабатывают во время первого или второго импульса. Источники, которые срабатывают во время первого импульса и имеют репликационные вилки, которые продолжают быть активными, имеют зелено-красно-зеленый паттерн (рис. 2B, ниже). Источники, которые инициируются во время второго импульса, имеют только зеленый паттерн (рис. 2B, вверху) и иногда называются вновь инициированными источниками, поэтому эти источники можно отличить от тех, которые инициируются во время первого импульса. Сравнение относительного процента новых источников между двумя экспериментальными условиями позволяет понять, как клетка реагирует на агент, повреждающий ДНК, или наличие или отсутствие белка. Терминации создаются, когда две репликационные вилки из соседних репликонов сливаются, и они имеют красно-зелено-красный паттерн (рис. 2D)³⁰.

Основываясь на фактах, описанных выше, анализ ДНК-волокна в настоящее время считается предпочтительным методом изучения изменений в динамике репликации ДНК, вызванных токсичными агентами, такими как наноматериалы. Исследователи теперь хорошо понимают и знают динамику полногеномной репликации ДНК у эукариот, как количественно, так и качественно, благодаря открытию этой технологии³⁶. На основе переменных результатов может быть принято несколько методологий. Некоторые примеры методов изучения вариаций повреждений ДНК, вызванных внешними агентами/наночастицами, показаны на рисунке 3. Общая цель метода анализа ДНК-волокна, описанного в этом исследовании, состоит в том, чтобы определить, как наночастицы влияют на процесс репликации in vitro и как они по-разному влияют на различные ткани.

Protocol

1. Подготовка антител и буфера Приготовьте первичный раствор антител, мышиный анти-BrdU в разведении 1:300 в 5% BSA и анти-BrdU крысы в разведении 1:500 в 5% BSA. Приготовьте вторичный раствор антител, alexafluor 594 rabbit anti-mouse в разведении 1:300 в 5% BSA и alexafluor 488 chicken anti-rat в разведении 1:500 в 5% BSA.</…

Representative Results

После получения достаточного количества изображений (от 20 до 100 изображений на условие) необходимо идентифицировать, измерить и подсчитать промежуточные продукты репликации. Независимо от того, анализируете ли волокна вручную или автоматически с помощью программы38, …

Discussion

Здесь мы обсуждаем метод, помогающий в анализе вариаций динамики репликации ДНК в присутствии наночастиц с помощью анализа волокна ДНК. Основные критические этапы, связанные со стандартным анализом, описаны в протоколе (этап 2.2.2 и этап 3.1.3). Всегда рекомендуется использовать область с о…

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416