İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma
Summary
İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC’ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC’lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisi iskemik miyokardın revaskülarize edilmesi için yapılan bir prosedürdür. Safen ven, arteriyel kanallara kıyasla azalmış uzun süreli açıklığa rağmen CABG kanalı olarak kullanılmaya devam etmektedir. Greft arteriyelizasyonu ile ilişkili hemodinamik stresin ani artışı, safen ven greftinin (SVG) düşük açıklığını etkileyebilecek vasküler hasara, özellikle de endotelle sonuçlanır. Burada, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC’ler) izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi anlatılmaktadır. Kollajenaz sindirimi ile izole edilen hücreler tipik parke taşı morfolojisini gösterir ve endotel hücre belirteçleri CD31 ve VE-kadherini eksprese eder. Mekanik stres etkisini değerlendirmek için, bu çalışmada, arteriyalize SVG’ler üzerindeki iki ana fiziksel uyaranı, kayma stresini ve gerilmeyi araştırmak için protokoller kullanılmıştır. hSVEC’ler, kayma gerilmesi üretmek için paralel bir plaka akış odasında kültürlenir, akış yönünde hizalama ve KLF2, KLF4 ve NOS3’ün artan ekspresyonunu gösterir. hSVEC’ler ayrıca venöz (düşük) ve arteriyel (yüksek) gerilmeyi taklit eden kontrollü hücresel gerilmeye izin veren bir silikon membranda kültürlenebilir. Endotel hücrelerinin F-aktin paterni ve nitrik oksit (NO) sekresyonu buna göre arteriyel gerilme ile modüle edilir. Özetle, hemodinamik mekanik stresin endotel fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için hSVEC’leri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.
Introduction
Endotel hücre (EC) disfonksiyonu safen ven greft yetmezliğinde anahtar rol oynar1,2,3,4. Kayma stresinin ve siklik gerilmenin sürekli artışı, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC’ler) proinflamatuar fenotipini indükler3,4,5,6. Altta yatan moleküler yollar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve in vitro çalışmalar için standartlaştırılmış protokoller, bölgedeki yeni anlayışlar için çabalardan yararlanabilir. Burada, hSVEC’leri izole etmek, karakterize etmek ve genişletmek için basit bir protokolü ve bunların venöz ve arteriyel hemodinamik koşulları taklit ederek değişken seviyelerde kayma stresi ve siklik gerilmeye nasıl maruz bırakılacağını açıklıyoruz.
hSVEC’ler kollajenaz inkübasyonu ile izole edilir ve 8. pasaja kadar kullanılabilir. Bu protokol, mevcut diğer protokollere kıyasla damarın daha az manipülasyonunu gerektirir7, bu da düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonu azaltır. Öte yandan, verimli EC ekstraksiyonuna sahip olmak için en az 2 cm’lik daha büyük bir kap segmenti gerektirir. Literatürde, büyük damarlardan alınan ECs’lerin mekanik uzaklaştırma ile de elde edilebileceği bildirilmiştir 7,8. Etkili olmasına rağmen, fiziksel yaklaşım düşük EC verimi ve daha yüksek fibroblast kontaminasyonu gibi dezavantajlara sahiptir. Saflığı arttırmak için, manyetik boncuklar veya hücre sıralama kullanarak ekstra adımlara ihtiyaç vardır, bu da boncukların ve antikorların elde edilmesi nedeniyle protokolün maliyetini arttırır7,8. Enzimatik yöntem, EC saflığı ve canlılığı ile ilgili daha hızlı ve daha iyi sonuçlara sahiptir 7,8.
Endotel disfonksiyonunu incelemek için en sık kullanılan EC’ler insan umbilikal ven endotel hücreleridir (HUVEC’ler). EC fenotipinin farklı damar yataklarında değiştiği bilinmektedir ve incelenen damarı temsil eden yöntemlerin geliştirilmesi esastır 9,10. Bu bakımdan, bir hSVEC’in izole edilmesi ve mekanik stres altında kültürlenmesi için bir protokol oluşturulması, ven grefti hastalığında hSVEC disfonksiyonunun katkısını anlamak için değerli bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
hSVEC’leri başarılı bir şekilde izole etmek için safen ven segmenti en az 2 cm olmalıdır. Küçük segmentlerin, hücreleri izole etmek için kollajenaz çözeltisini korumak için damarın uçlarını tutması ve bağlaması zordur. Azaltılmış luminal yüzey alanı, kültürü genişletmek için yeterli hücre vermez. ECs olmayanlarla kontaminasyon riskini en aza indirmek için, safen ven segmentinin manipülasyonu tüm prosedür boyunca çok nazik olmalıdır. Kanı çıkarmak için pipet uçlarını luminal …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ve 2013/17368-0] ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ve 309179/2013-0) hibeleriyle desteklenmektedir. AAM, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9) hibeleriyle desteklenmektedir.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Referenzen
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
