卵黄抗体に基づくサイトメトリービーズアッセイの標準化
Summary
このプロトコルは、抗原検出にIgY抗体を使用するアッセイ用のラテックスビーズを調製するための方法論を記載しています。
Abstract
イムノアッセイは、多数の分子標的を検出するための重要な検査です。現在利用可能な方法の中で、サイトメトリービーズアッセイはここ数十年で注目を集めています。装置によって読み取られる各マイクロスフェアは、試験対象の分子間の相互作用能力の分析イベントを表します。これらの数千のイベントが1回のアッセイで読み取られるため、高いアッセイ精度と再現性が保証されます。この方法論は、疾患の診断のためのIgY抗体などの新しいインプットの検証にも使用できます。これらの抗体は、目的の抗原でニワトリを免疫し、動物の卵の卵黄から免疫グロブリンを抽出することによって得られます。したがって、これは抗体を得るための痛みがなく生産性の高い方法です。この論文では、このアッセイの抗体認識能力を高精度に検証するための方法論に加えて、これらの抗体を抽出し、抗体とラテックスビーズの最適なカップリング条件を決定し、テストの感度を決定する方法も提示します。
Introduction
疾患の診断を目的としたイムノアッセイ技術の中で、サイトメトリービーズアッセイは、1回のアッセイで数千の粒子の分析を可能にするため、高感度で信頼性の高いアプローチとして浮上しています1。この手法は、生産性が高く、少量のサンプルを使用できることに加えて、サイトカイン、接着分子、抗体アイソタイプ、タンパク質などの複数の分子の検出を可能にするため、優れた柔軟性も備えています2,3。
これらのアッセイの開発には、効果的で低コストのインプットであるラテックスビーズなど、さまざまな粒子が使用されます。これらは、特定の分子の共有結合または非共有結合を可能にする官能基またはタンパク質の存在など、それらの表面に修飾を提示することができる3、4、5。
これらのイムノアッセイは、抗原や抗体などの成分を使用して疾患マーカーの検出を行い、一般的にマウス、ウサギ、ヤギなどの哺乳類由来の抗体を必要とします。哺乳類の予防接種は一般に多くの動物が良好な収量を得る必要があり、動物の苦しみにつながる手順を頻繁に実行する必要があるため、これは倫理的問題に関連する問題を引き起こします6,7。これに代わるものは、接種された抗原に対する高濃度の特異的抗体が卵黄中に見出され得るので、免疫されたニワトリの卵黄から単離されたIgY抗体の使用である。鶏肉の生産は、年間4.3匹のウサギの生産に相当します6,7。
したがって、このプロトコルの目的は、ラテックスビーズを用いたフローサイトメトリーを用いて鶏卵黄から得られたIgY抗体を評価する方法を提供することである。そこで我々は,ラテックスビーズを用いたサンドイッチ形式のサイトメトリービーズイムノアッセイの標準化法を提案する.モデルとして、熱帯熱マラリア原虫ヒスチジンリッチプロテインII抗原(IgY-Pf HRP2)を対象としたIgY抗体を使用しました。抗体を抽出する方法について説明し、ラテックスビーズへのこれらの結合濃度を定義するための重要なステップについて説明し、抗原の検出限界の評価を提示します。フローサイトメトリーの精度が高く、ラテックスビーズが低コストであるため、この手法は抗体や抗原などのイムノアッセイツールの分析に適用できます。この方法は、多様なターゲットの検出に使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
pH低下によるIgY抗体の沈殿法とそれに続くカプリル酸を用いた脂質分離法は、機能を損なうことなく全抗体を単離するのに効率的である。ここで提案された方法は、酸性化とカプリル酸による沈殿を使用したRedwanら11によって報告されたものよりも単純で安価ですが、より複雑で面倒なプロトコルを使用しています。この方法はまた、PEG沈殿12,13、硫酸ナトリウム<sup class="xref…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FIOCRUZ (「プログラム・デ・エクセレンシア・エム・ペスキサ・バシカ・エ・アプリカダ・エ・アプリカダ・エム・サウデ・ドス・ラボラトリオス・ド・インスティトゥート・レオニダス・エ・マリア・ディーン-ILMD/フィオクルス・アマゾニア-ILMD/FIOCRUZ AMAZÔNIA」)、バイオテクノロジー大学院プログラム(アマゾナス連邦大学-UFAM)、ペソアル・デ・ニベル研究所(CAPES)、および奨学金を提供してくれたアンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタード・ド・アマゾナス財団(FAPEAM)に感謝します。図 2 と 図 4 は biorender.com で作成したものです。
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
Referenzen
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