Un flusso di lavoro per l'ottimizzazione della formulazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzando esperimenti di processo di miscela progettati e modelli di ensemble autoconvalidati (SVEM)

Summary

Questo protocollo fornisce un approccio all’ottimizzazione della formulazione rispetto a fattori di studio di miscela, continui e categoriali che riduce al minimo le scelte soggettive nella costruzione del progetto sperimentale. Per la fase di analisi, viene impiegata una procedura di adattamento di modellazione efficace e facile da usare.

Abstract

Presentiamo un approccio in stile Quality by Design (QbD) per l’ottimizzazione delle formulazioni di nanoparticelle lipidiche (LNP), con l’obiettivo di offrire agli scienziati un flusso di lavoro accessibile. La restrizione intrinseca in questi studi, in cui i rapporti molari dei lipidi ionizzabili, helper e PEG devono sommarsi fino al 100%, richiede metodi di progettazione e analisi specializzati per soddisfare questo vincolo di miscela. Concentrandoci sui fattori lipidici e di processo comunemente utilizzati nell’ottimizzazione della progettazione LNP, forniamo passaggi che evitano molte delle difficoltà che tradizionalmente sorgono nella progettazione e nell’analisi di esperimenti di processo di miscelazione impiegando progetti di riempimento dello spazio e utilizzando il quadro statistico recentemente sviluppato di modelli di ensemble autoconvalidati (SVEM). Oltre a produrre formulazioni ottimali candidate, il flusso di lavoro crea anche riepiloghi grafici dei modelli statistici adattati che semplificano l’interpretazione dei risultati. Le formulazioni candidate appena identificate vengono valutate con cicli di conferma e facoltativamente possono essere condotte nel contesto di uno studio di seconda fase più completo.

Introduction

Le formulazioni di nanoparticelle lipidiche (LNP) per sistemi di rilascio genico in vivo coinvolgono generalmente quattro lipidi costituenti delle categorie di lipidi ionizzabili, helper e PEG ^1,2,3. Sia che questi lipidi vengano studiati da soli o contemporaneamente ad altri fattori non miscelati, gli esperimenti per queste formulazioni richiedono disegni di “miscela” perché – data una formulazione candidata – aumentare o diminuire il rapporto di uno qualsiasi dei lipidi porta necessariamente ad una corrispondente diminuzione o aumento della somma dei rapporti degli altri tre lipidi.

Per esempio, si suppone che stiamo ottimizzando una formulazione LNP che attualmente utilizza una ricetta impostata che verrà trattata come punto di riferimento. L’obiettivo è massimizzare la potenza del LNP mentre secondariamente mira a ridurre al minimo la dimensione media delle particelle. I fattori di studio che variano nell’esperimento sono i rapporti molari dei quattro lipidi costituenti (ionizzabili, colesterolo, DOPE, PEG), il rapporto N/P, la portata e il tipo di lipide ionizzabile. I lipidi ionizzabili e helper (compreso il colesterolo) possono variare su un intervallo più ampio di rapporto molare, 10-60%, rispetto al PEG, che sarà variato dall’1-5% in questa illustrazione. La ricetta di formulazione di riferimento e gli intervalli degli altri fattori e la loro granularità di arrotondamento sono specificati nella scheda supplementare 1. Per questo esempio, gli scienziati sono in grado di eseguire 23 esecuzioni (lotti unici di particelle) in un solo giorno e vorrebbero usarlo come dimensione del campione se soddisfa i requisiti minimi. I risultati simulati per questo esperimento sono disponibili nel file supplementare 2 e nel file supplementare 3.

Rampado e Peer⁴ hanno pubblicato un recente documento di revisione sul tema degli esperimenti progettati per l’ottimizzazione dei sistemi di somministrazione di farmaci basati su nanoparticelle. Kauffman et ^al.5 hanno considerato studi di ottimizzazione LNP utilizzando disegni di screening fattoriale frazionario e definitivo⁶; Tuttavia, questi tipi di disegni e modelli non possono soddisfare un vincolo di miscela senza ricorrere all’uso di “variabili di allentamento” ^{inefficienti7} e non sono tipicamente utilizzati quando sono presenti fattori di miscela ^7,8. Invece, i “progetti ottimali” in grado di incorporare un vincolo di miscela sono tradizionalmente utilizzati per esperimenti di processo di miscela⁹. Questi disegni mirano a una funzione specificata dall’utente dei fattori di studio e sono ottimali (in uno dei numerosi sensi possibili) solo se questa funzione cattura la vera relazione tra i fattori di studio e le risposte. Si noti che vi è una distinzione nel testo tra “progetti ottimali” e “candidati formulativi ottimali”, con quest’ultimo che si riferisce alle migliori formulazioni identificate da un modello statistico. I progetti ottimali presentano tre svantaggi principali per gli esperimenti di processo di miscela. In primo luogo, se lo scienziato non riesce ad anticipare un’interazione dei fattori di studio quando specifica il modello target, allora il modello risultante sarà distorto e può produrre formulazioni candidate inferiori. In secondo luogo, i progetti ottimali posizionano la maggior parte delle corse sul confine esterno dello spazio fattoriale. Negli studi LNP, questo può portare a un gran numero di corse perse se le particelle non si formano correttamente a qualsiasi estremo delle impostazioni lipidiche o di processo. In terzo luogo, gli scienziati spesso preferiscono avere corse sperimentali all’interno dello spazio fattoriale per ottenere un senso indipendente dal modello della superficie di risposta e per osservare il processo direttamente in regioni precedentemente inesplorate dello spazio fattoriale.

Un principio di progettazione alternativo consiste nell’mirare a una copertura uniforme approssimativa dello spazio dei fattori (vincolato dalla miscela) con un design che riempie lo spazio¹⁰. Questi progetti sacrificano una certa efficienza sperimentale rispetto ai progetti ottimali⁹ (supponendo che l’intero spazio fattoriale porti a formulazioni valide) ma presentano diversi vantaggi in un compromesso che sono utili in questa applicazione. Il design di riempimento dello spazio non fa alcuna ipotesi a priori sulla struttura della superficie di risposta; Ciò gli conferisce la flessibilità di catturare relazioni impreviste tra i fattori di studio. Ciò semplifica anche la generazione del progetto perché non richiede di prendere decisioni su quali termini di regressione aggiungere o rimuovere quando viene regolata la dimensione di esecuzione desiderata. Quando alcuni punti di progettazione (ricette) portano a formulazioni fallite, i progetti di riempimento dello spazio consentono di modellare il limite del fallimento sui fattori di studio, supportando anche modelli statistici per le risposte allo studio rispetto alle combinazioni di fattori di successo. Infine, la copertura interna dello spazio fattoriale consente un’esplorazione grafica indipendente dal modello della superficie di risposta.

Per visualizzare il sottospazio del fattore di miscela di un esperimento di processo di miscelazione, vengono utilizzati “grafici ternari” triangolari specializzati. La figura 1 motiva questo utilizzo: nel cubo di punti in cui tre ingredienti possono essere compresi tra 0 e 1, i punti che soddisfano un vincolo secondo cui la somma degli ingredienti è uguale a 1 sono evidenziati in rosso. Il vincolo della miscela sui tre ingredienti riduce lo spazio dei fattori fattibili a un triangolo. Nelle applicazioni LNP con quattro ingredienti di miscela, produciamo sei diversi grafici ternari per rappresentare lo spazio fattoriale tracciando due lipidi alla volta contro un asse “Altri” che rappresenta la somma degli altri lipidi.

Figura 1: Regioni a fattore triangolare. Nel grafico di riempimento dello spazio all’interno del cubo, i piccoli punti grigi rappresentano formulazioni incoerenti con il vincolo della miscela. I punti rossi più grandi giacciono su un triangolo inscritto all’interno del cubo e rappresentano formulazioni per le quali il vincolo della miscela è soddisfatto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Oltre ai fattori di miscela lipidica, ci sono spesso uno o più fattori di processo continui come il rapporto N: P, la concentrazione del tampone o la portata. Possono essere presenti fattori categoriali, come il tipo di lipide ionizzabile, il tipo di lipidi helper o il tipo di tampone. L’obiettivo è trovare una formulazione (una miscela di lipidi e impostazioni per i fattori di processo) che massimizzi una certa misura di potenza e / o migliori le caratteristiche fisico-chimiche come minimizzare la dimensione delle particelle e il PDI (indice di polidispersione), massimizzare l’incapsulamento percentuale e minimizzare gli effetti collaterali – come la perdita di peso corporeo – negli studi in vivo . Anche quando si parte da una ricetta di riferimento ragionevole, potrebbe esserci interesse a ri-ottimizzare dato un cambiamento nel carico utile genetico o quando si considerano cambiamenti nei fattori di processo o nei tipi lipidici.

Cornell⁷ fornisce un testo definitivo sugli aspetti statistici degli esperimenti di miscela e processo di miscelazione, con Myers et ^al.9 che fornisce un eccellente riassunto degli argomenti di progettazione e analisi delle miscele più rilevanti per l’ottimizzazione. Tuttavia, questi lavori possono sovraccaricare gli scienziati con dettagli statistici e con terminologia specializzata. Il software moderno per la progettazione e l’analisi degli esperimenti fornisce una soluzione robusta che supporterà sufficientemente la maggior parte dei problemi di ottimizzazione LNP senza dover ricorrere alla teoria pertinente. Mentre gli studi più complicati o ad alta priorità trarranno comunque beneficio dalla collaborazione con uno statistico e potrebbero impiegare progetti ottimali piuttosto che ingombranti, il nostro obiettivo è migliorare il livello di comfort degli scienziati e incoraggiare l’ottimizzazione delle formulazioni LNP senza fare appello a test inefficienti a un fattore alla volta (OFAT)¹¹ o semplicemente accontentarsi della prima formulazione che soddisfa le specifiche.

In questo articolo viene presentato un flusso di lavoro che utilizza software statistico per ottimizzare un problema di formulazione LNP generico, affrontando i problemi di progettazione e analisi nell’ordine in cui verranno riscontrati. In effetti, il metodo funzionerà per problemi di ottimizzazione generali e non è limitato agli LNP. Lungo il percorso, vengono affrontate diverse domande comuni che sorgono e vengono fornite raccomandazioni basate sull’esperienza e sui risultati della simulazione¹². Il framework recentemente sviluppato di modelli di ensemble autoconvalidati (SVEM)¹³ ha notevolmente migliorato l’approccio altrimenti fragile all’analisi dei risultati degli esperimenti sui processi di miscelazione e utilizziamo questo approccio per fornire una strategia semplificata per l’ottimizzazione della formulazione. Mentre il flusso di lavoro è costruito in modo generale che potrebbe essere seguito utilizzando altri pacchetti software, JMP 17 Pro è unico nell’offrire SVEM insieme agli strumenti di riepilogo grafico che abbiamo trovato necessari per semplificare l’analisi altrimenti arcana degli esperimenti di processo di miscela. Di conseguenza, nel protocollo vengono fornite anche istruzioni specifiche per JMP.

SVEM utilizza la stessa base del modello di regressione lineare dell’approccio tradizionale, ma ci consente di evitare noiose modifiche necessarie per adattarsi a un “modello completo” di effetti candidati utilizzando un approccio di base di selezione in avanti o di selezione penalizzata (Lazo). Inoltre, SVEM fornisce un “modello ridotto” migliorato che riduce al minimo il potenziale di incorporare il rumore (processo più varianza analitica) che appare nei dati. Funziona calcolando la media dei modelli previsti risultanti dalla riponderazione ripetuta dell’importanza relativa di ciascuna esecuzione nel modello 13,14,15,16,17,18. SVEM fornisce un framework per la modellazione di esperimenti di processo di miscela che è sia più facile da implementare rispetto alla tradizionale regressione a colpo singolo e produce candidati di formulazione ottimale di migliore qualità^12,13. I dettagli matematici di SVEM vanno oltre lo scopo di questo documento e anche un sommario sommario oltre la revisione della letteratura pertinente distrarrebbe dal suo principale vantaggio in questa applicazione: consente una procedura click-to-run semplice, robusta e accurata per i professionisti.

Il flusso di lavoro presentato è coerente con l’approccio Quality by Design (QbD)¹⁹ allo sviluppo farmaceutico²⁰. Il risultato dello studio sarà la comprensione della relazione funzionale che collega gli attributi dei materiali e i parametri di processo agli attributi critici di qualità (CQA)²¹. Daniel et ^al.22 discutono l’utilizzo di un framework QbD specifico per la produzione di piattaforme RNA: il nostro flusso di lavoro potrebbe essere utilizzato come strumento all’interno di questo framework.

Protocol

L’esperimento descritto nella sezione Risultati rappresentativi è stato condotto in conformità con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida stabilite dal nostro Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC). Sono stati ottenuti commercialmente topi femmina Balb/C di 6-8 settimane. Gli animali hanno ricevuto ad libitum chow e acqua standard e sono stati alloggiati in condizioni standard con cicli luce / buio di 12 ore…

Representative Results

Questo approccio è stato convalidato in entrambi i tipi lipidici ampiamente classificati: lipidi classici simili a MC3 e lipidoidi (ad esempio, C12-200), generalmente derivati dalla chimica combinatoria. Rispetto a una formulazione LNP di riferimento sviluppata utilizzando un metodo One Factor at a Time (OFAT), le formulazioni candidate generate attraverso il nostro flusso di lavoro dimostrano spesso miglioramenti di potenza da 4 a 5 volte su scala logaritmica, come mostrato nelle letture della luciferasi epatica di top…

Discussion

Il moderno software per la progettazione e l’analisi di esperimenti di processo di miscela consente agli scienziati di migliorare le loro formulazioni di nanoparticelle lipidiche in un flusso di lavoro strutturato che evita una sperimentazione OFAT inefficiente. L’approccio di modellazione SVEM recentemente sviluppato elimina molte delle modifiche di regressione arcana e delle strategie di riduzione del modello che potrebbero aver precedentemente distratto gli scienziati con considerazioni statistiche estranee. Una volta…

Materials

JMP Pro 17.1

JMP Statistical Discovery LLC