Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco
Summary
Os organoides tumorais revolucionaram a pesquisa do câncer e a abordagem da medicina personalizada. Eles representam um modelo de tumor clinicamente relevante que permite aos pesquisadores ficar um passo à frente do tumor na clínica. Este protocolo estabelece organoides tumorais a partir de amostras de tecido tumoral pancreático fresco e xenoenxertos derivados do paciente de origem adenocarcinoma pancreático.
Abstract
Os organoides tumorais são modelos tumorais tridimensionais (3D) ex vivo que recapitulam as características-chave biológicas dos tecidos tumorais primários originais. Organoides tumorais derivados de pacientes têm sido usados em pesquisas translacionais sobre câncer e podem ser aplicados para avaliar a sensibilidade e resistência ao tratamento, interações célula-célula e interações de células tumorais com o microambiente tumoral. Os organoides tumorais são sistemas de cultura complexos que requerem técnicas avançadas de cultura celular e meios de cultura com coquetéis específicos de fatores de crescimento e uma membrana basal biológica que mimetiza o ambiente extracelular. A capacidade de estabelecer culturas de tumores primários depende muito do tecido de origem, da celularidade e das características clínicas do tumor, como o grau tumoral. Além disso, a coleta de amostras de tecido, a qualidade e quantidade do material, bem como o correto biobanco e armazenamento são elementos cruciais desse procedimento. As capacidades técnicas do laboratório também são fatores cruciais a serem considerados. Aqui, relatamos um POP/protocolo validado que é técnica e economicamente viável para a cultura de organoides tumorais ex vivo a partir de amostras de tecido fresco de origem adenocarcinoma pancreático, seja a partir de tecido doador primário ressecado a fresco ou xenoenxertos derivados do paciente (PDX). A técnica aqui descrita pode ser realizada em laboratórios com cultura básica de tecidos e instalações em camundongos e é adaptada para ampla aplicação no campo da oncologia translacional.
Introduction
Os organoides tumorais são culturas tridimensionais (3D) organizadas ex vivo que são derivadas do tecido tumoral fresco e fornecem modelos de câncer. Os organoides tumorais recapitulam as características biológicas fundamentais do tumor primário original1,2,3,4 e podem ser expandidos por até vários meses e criopreservados, semelhante às linhagens celulares imortalizadas convencionais. Os organoides tumorais fornecem um biobanco de modelos tumorais derivados do paciente para medicina translacional/personalizada5 e representam um importante avanço nos sistemas/modelos de biologia de células cancerosas. Organoides tumorais derivados do paciente podem ser usados como modelos ex vivo para predizer a eficácia de terapias oncológicas/farmacológicas (neo)adjuvantes, para as quais culturas são estabelecidas a partir de tecido tumoral fresco e ensaios de sensibilidade a drogas ou farmacotipagem são realizados em uma base específica do paciente para identificar agentes eficazes para linhas de terapiasubsequentes1,4. Além disso, os organoides tumorais superam a limitação da disponibilidade de tecido tumoral primário e, mais importante, fornecem um excelente sistema alternativo ou complementar aos modelos de camundongos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX)2. A complexidade dos organoides tumorais aumenta se as células tumorais primárias são combinadas com células estromais encontradas no microambiente tumoral (TME), como fibroblastos associados ao câncer (CAFs), células endoteliais e células imunes, que mimetizam o funcionamento e a complexa celularidade do tumor primário. Organoides tumorais têm sido estabelecidos para vários tipos de tumores utilizando protocolos padronizados6,7,8,9,10. A propagação organoide a partir de diferentes tumores sólidos, incluindo tecido colorretal e câncer de mama, é bem estabelecida e tecnicamente acessível 11,12,13,14,15.
Ressecções cirúrgicas de tumores ou biópsias tumorais fornecem espécimes de tecido tumoral primário. Idealmente, os espécimes de tecido tumoral devem vir do centro da massa tumoral ou da borda invasora do tumor, bem como do tecido de aparência normal adjacente ao tumor. Em comparação com culturas 2D convencionais, os organoides tumorais requerem vários “add-ons”, incluindo uma membrana basal biológica (como Matrigel, hidrogel ou um arcabouço à base de colágeno), que imita a TME extracelular, e um meio de crescimento líquido que fornece nutrientes e fatores de crescimento específicos e suporta a proliferação e viabilidade celular em cultura16.
Os passos mais básicos na cultura de células primárias são lavar o tecido em solução salina para evitar contaminação, cortar/digerir mecanicamente o tumor em pequenos pedaços de 1-3 mm3 e tratamento com colagenase para a digestão enzimática do tecido. A mistura digerida é então filtrada para remover grandes fragmentos de tecido, ressuspensa em uma membrana basal biológica como Matrigel, e plaqueada como cúpulas em placas de cultura de baixa fixação para aumentar o crescimento não aderente. As cúpulas da matriz da membrana basal são cobertas com meio de cultura líquido e suplementadas com glutamina e antibióticos para evitar contaminação, bem como com fatores de crescimento específicos dependendo do tipo de tecido 7,8,9,16,17. Outras células relevantes presentes no tumor em massa e na EMT também podem ser isoladas, como fibroblastos associados ao câncer (CAFs) e células imunes. Essa técnica, recentementerevisada18, permite o estabelecimento de coculturas com diferentes tipos celulares para estudar a resposta à terapia em um ambiente tumoral mais “realista”. Além disso, as interações célula-célula e a interação entre células tumorais e componentes da matriz biológica circundante podem ser estudadas.
A taxa de sucesso relatada do estabelecimento organoide tumoral usando tecido fresco de biópsias ou tecido tumoral gastrointestinal ressecado é de cerca de 50%11, e a taxa de sucesso deste último é amplamente dependente do tipo e origem dotecido4, particularmente do grau tumoral e da celularidade tumoral global. Modelos tumorais tridimensionais têm complexidade variável, desde agregados unicelulares simples até modelos de engenharia altamente complexos consistindo de vários tipos celulares. A terminologia utilizada para descrever culturas 3D na literatura é altamente inconsistente 19,20,21, pois diferentes termos como esferoides, tumoresferas e organoides são usados, embora a diferença entre eles não seja clara. Como um consenso claro sobre a definição ainda não foi alcançado, neste artigo, um organoide tumoral é descrito como uma cultura de células tumorais organizada embebida em uma membrana basal biológica.
Neste trabalho, um protocolo validado é relatado para o estabelecimento de organoides tumorais a partir de amostras de tecido fresco provenientes de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) primário ressecado ou derivado do PDX, e esse protocolo pode ser realizado na maioria dos laboratórios com instalações básicas de cultura de tecidos. Este protocolo foi adaptado de vários protocolos relatados no estado da arte que são atualmente usados para estabelecer organoides tumorais ou tumoróides a partir do tecido tumoral digestivo dos grupos de David Tuveson9, HansClevers8 e Aurel Perren7.
Este protocolo não discute como o tecido fresco é retirado. Para obter tecido tumoral humano fresco de alta qualidade, é importante ter uma coordenação eficiente entre os cirurgiões que coletam o tecido e o departamento de patologia que extrai a amostra de tecido para cultura de organoides. Da mesma forma, ao usar PDX como fonte de tecido fresco, a coordenação eficiente com a pessoa que coleta a amostra de tecido também é importante. É fundamental obter a amostra de tecido o mais rápido possível (dentro de 30-60 min a partir do momento da colheita), a fim de manter uma alta qualidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grandes avanços nas terapias farmacológicas do câncer são desafiadores, pois a probabilidade de aprovação de fármacos em ensaios clínicos oncológicos de fase I é de 5,1%, sendo a menor de todos os tipos dedoenças23. A principal razão é que o câncer é muito heterogêneo e, portanto, as coortes de pacientes não respondem uniformemente como esperado ao tratamento dado, o que destaca que uma abordagem mais personalizada é necessária. Culturas bidimensionais (2D) têm sido usadas em p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo financiamento da Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Programa de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção n.º 857381, projeto VISION (Estratégias para reforçar a excelência científica e a capacidade de inovação para o diagnóstico precoce de cancros gastrointestinais), Chamada intramuros para novos projetos de pesquisa para pesquisadores clínicos e grupos de pesquisa emergentes IRYCIS (2021/0446), Projeto Organoides Derivados do Paciente 2.0 (CIBERONC) e o projeto TRANSCAN II JTC 2017 chamada “Estabelecendo um algoritmo para o diagnóstico precoce e acompanhamento de pacientes com tumores neuroendócrinos pancreáticos (NExT)”, número de concessão 1.1.1.5/ERANET/20/03. As amostras biológicas utilizadas neste protocolo foram cedidas pelo BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) e integradas à Plataforma de Biobancos e Biomodelos do ISCIII (PT20/00045). Também gostaríamos de agradecer a Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita e Thorsten Knoll por seu inestimável apoio para desenvolver este protocolo como parte dos projetos NExT e VISION.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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