تحسين عملية تربية الدبابير الخالية من الجراثيم
Summary
تم تشريح أجنة دبور ناسونيا من الشرانق Lucillia sericata بعد التطفل لمدة 12-24 ساعة وغسلها بالكحول ومحلول هيبوكلوريت الصوديوم 10٪ للحصول على أجنة خالية من الجراثيم. بعد تربية الأجنة الخالية من الجراثيم وتزويدها بوسط تربية Nasonia للنمو والتطور في المختبر ، تم الحصول على Nasonia البالغين الخالية من الجراثيم.
Abstract
تكنولوجيا التربية المعقمة هي طريقة لاستزراع الحشرات في ظل ظروف معقمة أو شبه معقمة ، والتي يمكن أن تقضي بشكل فعال على تأثير الكائنات الحية الدقيقة الخارجية على ميكروبات الحشرات وبالتالي تعزيز التطور السريع لأبحاث ميكروبات الحشرات. Nasonia (جنس الدبور) هي حشرة دبور طفيلية لها العديد من المزايا ، مثل العمر القصير ، والتباين الجيني العالي ، وسهولة التشغيل ، وما إلى ذلك ، وتستخدم على نطاق واسع كنظام نموذج للحشرات. على عكس العلاج بالمضادات الحيوية ، الذي يمكن أن يقلل فقط من عدد الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات ، يمكن لتقنيات التربية المعقمة التحكم في تكوين وكمية الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات ، مما يسهل دراسة تفاعلات المضيف والميكروب. ومع ذلك ، فإن الإصدارات السابقة من وسط تربية Nasonia (NRM) بها بعض العيوب والمشاكل ، مثل عملية التحضير المعقدة والمستهلكة للوقت ، والتلوث السهل بالبكتيريا أو الفطريات ، ووقت التخزين القصير. لذلك ، تحل هذه الدراسة هذه المشكلات من خلال تحسين الأدوات المستخدمة في عملية إعداد NRM وظروف التخزين ونسب المكونات. يمكن أن يسمح الوسط الأمثل بالتخزين عند -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل والقضاء على إمكانية تلوث NRM أثناء تغذية الدبابير المعقمة. هذا يحسن معدل البقاء على قيد الحياة والمستوى الصحي ل Nasonia المعقم ، وهو أمر مهم لاستخدام Nasonia كنموذج للبحوث الميكروبية.
Introduction
الحيوانات الخالية من الجراثيم هي لا تحتوي على كائنات حية حية وطفيليات يمكن اكتشافها1. يمكن الحصول على أجنة خالية من الجراثيم عن طريق تشريح الأم في ظل ظروف معقمة ثم تربيتها لاحقا في أنظمة الحاجز2. يمكن استخدام هذه الحيوانات لدراسة آثار الكائنات الحية الدقيقة على الحيوانات ، مثل الجراثيم المعوية ، والجهاز المناعي ، والتمثيل الغذائي1. مع بعض الوسائل التقنية ، يمكن جعل العديد من الحشرات وحتى الثدييات معقمة 3,4. تلعب الحيوانات الخالية من الجراثيم دورا فريدا وقد استخدمت على نطاق واسع في جوانب مختلفة من أبحاث علم الأحياء الدقيقة5. على سبيل المثال ، كشف استخدام دبابير Nasonia الخالية من الجراثيم أن الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تساعد المضيفين على التكيف مع البيئات الجديدة تحت الضغط البيئي الخارجي طويل الأجل 6,7.
طفيليات Nasonia هي دبابير طفيلية صغيرة تحقن بيضها في شرانق الذباب4. هناك أربعة أنواع معروفة من ناسونيا ، بما في ذلك Nasonia vitripennis و Nasonia longicornis و Nasonia giraulti و Nasonia oneida8. يمكن العثور على N. vitripennis في جميع أنحاء العالم ، في حين أن الأنواع الثلاثة الأخرى لها نطاقات محدودة في أمريكا الشمالية4. تعتبر الدبابير الطفيلية Nasonia حشرات نموذجية مثالية بسبب خصائصها ، مثل سهولة الزراعة ، ودورة التكاثر القصيرة ، والجينوم المتسلسل ، و diapause طويل المدى 8,9. يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من تطور الحشرات ، وعلم الوراثة ، والتنمية ، والسلوك ، والتكافل10. علاوة على ذلك ، يمكن أن تساعد الدبابير الطفيلية Nasonia أيضا في السيطرة على الذباب الضار في الزراعة والأمراض11. يتضمن الإنشاء الناجح لنظام الحشرات العقيمة خطوتين رئيسيتين: (1) تعقيم الأجنة و (2) توفير الغذاء المعقم لليرقات في المختبر. من أجل الحصول على طعام معقم ، طور Brucker and Bordenstein 12 وسط تربية Nasonia (NRMv1) في عام 2012 باستخدام مواد كيميائية مثل المضادات الحيوية والمبيض ومصل الجنين البقري لقتل البكتيريا12. ومع ذلك ، أدت طريقة التعقيم الكيميائي إلى انخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة و eclosion من N. vitripennis13. ثم ، في عام 2016 ، شروبشاير وآخرون طور NRMv2 باستخدام طريقة تعقيم المرشح بدلا من طريقة التعقيم الكيميائي للقضاء على مخاطر المضادات الحيوية والمواد الأخرى ، وتحسين عملية التكاثر13. لسوء الحظ ، لا تزال هذه الطريقة لها بعض العيوب ، مثل التحديات المرتبطة بإعداد واستخدام الوسط ، فضلا عن مخاطر الغرق أو نقص التغذية أو الجفاف للأجنة واليرقات والشرانق المغلقة14. قام وانغ وبروكر14 مؤخرا بتحسين وسائط تربية ناسونيا الإصدار 3 (NRMv3) وبروتوكولات الإصدار 2 من التربية الخالية من الجراثيم (GFRv2). خفضت هذه التحسينات التكلفة واستهلاك الوسائط. ومع ذلك ، فإن NRMv3 لديه وقت تخزين قصير جدا وهو شديد التأثر بالتلوث.
بناء على NRMv3 ، تم تحسين طريقة تخزين أداة تحضير NRM ونسبة المغذيات في هذه الدراسة. يسهل هذا التحسين المنهجي استخدام N. vitripennis كنموذج لدراسات الميكروبيوم. بالمقارنة مع NRMv3 الذي طوره Wang et al.14 ، فإن الأداة المحسنة للضغط على Sarcophaga bullata pupa ، إحدى المواد الخام NRM ، تعزز بشكل كبير كفاءة إنتاج سائل الأنسجة S. bullata pupa مقارنة بحقنة 60 مل مع ثقب سفلي يستخدمه Wang et al.14. قمنا بتعديل نسبة المغذيات من NRM ، مما أدى إلى زيادة معينة في معدل بقاء دبابير Nasonia الخالية من الجراثيم دون التأثير على وقت نموها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعبئة NRM في أنابيب طرد مركزي ذات سعة صغيرة (1.5 مل) وتجميدها في ثلاجة -20 درجة مئوية لتمديد وقت التخزين. تجدر الإشارة إلى أنه بينما استخدمنا الذبابة المنزلية Lucilia sericata كمضيف ومصدر لإعداد NRM ، فمن المحتمل أن يتم تكييف هذا البروتوكول مع مضيفات Nasonia الأخرى المتوفرة في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع تطبيق تقنيات الكشف عالية الإنتاجية مثل علم الجينوم والأيض ، أدرك الباحثون تدريجيا أن هناك تنوعا وراثيا هائلا وتعقيدا أيضيا في ميكروبيوتا الأمعاء16. ترتبط هذه البكتيريا التكافلية ارتباطا وثيقا بحالات فسيولوجية أو مرضية مختلفة ، مثل التمثيل الغذائي الغذائي للمضيف ، والأور?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (32270538) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFF0710603) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في بكين (6222046) ، والتمويل الاستراتيجي CAS عبر مخطط تمويل CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) الممنوح ل G.H.W. مساهمات المؤلف: طور جميع المؤلفين نطاق المراجعة وتركيزها وساهموا في كتابة المخطوطة.
Materials
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
Referenzen
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
