골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정
Summary
기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca2+ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.
Abstract
기능적 부위 지정 형광 측정법은 전압 개폐 이온 채널을 포함한 수많은 막 단백질의 구조-기능 관계를 조사하기 위해 선택되는 기술이었습니다. 이 접근법은 주로 이종 발현 시스템에서 멤브레인 전류, 채널 활동의 전기적 발현 및 형광 측정을 동시에 측정하여 로컬 도메인 재배열을 보고하는 데 사용되었습니다. 기능적 부위 지정 형광 측정법은 전기 생리학, 분자 생물학, 화학 및 형광을 형광 및 전기 생리학을 통해 실시간 구조 재배열 및 기능을 연구할 수 있는 광범위한 단일 기술로 결합합니다. 일반적으로 이 접근 방식에는 티올 반응성 형광 염료로 테스트할 수 있는 시스테인을 포함하는 엔지니어링된 전압 개폐 멤브레인 채널이 필요합니다. 최근까지 단백질의 부위 지향 형광 표지에 사용된 티올 반응성 화학은 Xenopus 난모세포 및 세포주에서만 수행되어 1차 비흥분성 세포에 대한 접근 범위를 제한했습니다. 이 보고서는 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링의 초기 단계를 연구하기 위해 성인 골격근 세포에서 기능적 부위 지시 형광 측정법의 적용 가능성을 설명합니다. 본 프로토콜은 생체 내 전기천공을 사용하여 시스테인 공학 전압 개폐 Ca2+ 채널(CaV1.1)을 설계하고 성인 마우스의 굴근 손가락 브레비스의 근육 섬유로 형질감염시키는 방법론과 기능적 부위 지정 형광 측정 측정에 필요한 후속 단계를 설명합니다. 이 접근법은 다른 이온 채널과 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 포유류 근육의 기능적 부위 지정 형광 측정법의 사용은 특히 흥분성의 기본 메커니즘을 연구하는 것과 관련이 있습니다.
Introduction
살아있는 세포에서 알려진 전기적 자극에 대한 반응으로 이온 채널 구조적 재배열을 추적하는 능력은 분자 생리학에 대한 귀중한 정보의 원천입니다1. 전압 개폐 이온 채널은 막횡단 전압의 변화를 감지하는 막 단백질이며, 그 기능도 전압 변화의 영향을 받습니다2. 지난 세기의 전압 클램프 기술의 발전으로 생리학자들은 막 탈분극에 반응하여 전압 개폐 이온 채널에 의해 전달되는 이온 전류를 실시간으로 연구할 수 있었습니다3. 전압 클램프 기술의 사용은 뉴런 및 근육과 같은 흥분성 세포의 전기적 특성을 이해하는 데 중요했습니다. 1970년대에는 전압 클램프 미세 조정을 통해 전압 개폐 칼슘(CaV) 및 나트륨(NaV) 채널 4,5에서 게이팅 전류(또는 전하 이동)를 감지할 수 있었습니다. 게이팅 전류는 세포막6을 가로지르는 전기장의 변화에 반응하여 전압 센서의 움직임에서 발생하는 비선형 용량성 전류입니다. 게이팅 전류는 이온 채널 개방7 이전 또는 수반되는 분자 재배열의 전기적 표현으로 간주된다. 이러한 전류 측정은 채널의 기능에 관한 귀중한 정보를 제공하지만, 이온 전류와 게이팅 전류는 모두 전압 개폐 채널7의 분자 간 및 분자 내 구조적 재배열에 대한 간접적인 판독값입니다.
1990년대 초반에 개발된 기능적 부위 지정 형광 측정법(FSDF, Voltage Clamp Fluorometry, VCF라고도 함)은8 처음으로 국소 구조적 변화와 채널 단백질의 기능을 실시간으로 직접 볼 수 있는 기능을 제공했습니다. 채널 돌연변이 유발, 전기생리학 및 이종 발현 시스템의 조합을 사용하여, 활성화 자극에 반응하여 특정 채널 또는 수용체의 움직이는 부분을 형광으로 태깅하고 추적할 수 있다(9,10). 이 접근법은 전압 개폐 이온 채널 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19에서 전압 감지 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 권위 있는 리뷰는 10,20,21,22,23을 참조하십시오.
전기 신호의 개시 및 전파에 중요한 Ca V 및 NaV 채널은 중앙 기공과 4개의 동일하지 않은 전압 감지 도메인2을 가진 메인 α1 서브유닛으로 구성됩니다. 이들의 뚜렷한 1차 구조에 더하여, CaV 및NaV 채널은 보조 서브유닛(24)을 갖는 다중 서브유닛 복합체로서 표현된다. 전압 의존성 칼륨 채널(KV)은 NaV 또는CaV25의 단일 도메인처럼 보이는 4 개의 서브 유닛으로 구성됩니다. CaV 및NaV 채널의 기공 형성 및 전압 감지 α1 서브유닛은 6개의 고유한 막횡단 세그먼트의 4개의 개별 도메인을 암호화하는 단일 폴리펩티드에 의해 형성된다(S1-S6; 그림 1A) 24,26. S1 내지 S4 막횡단 세그먼트로 구성된 영역은 전압 감지 도메인(VSD)을 형성하고, S5 및 S6 막횡단 세그먼트는 공극 도메인(26)을 형성한다. 각 VSD에서 S4 α 나선에는 양전하를 띤 아르기닌 또는 라이신(그림 1A, B)이 포함되어 있으며, 이 아르기닌 또는 라이신은 멤브레인 탈분극에 반응하여 움직입니다7. 수십 년에 걸친 연구와 매우 다양한 실험적 접근 방식의 결과는 S4 세그먼트가 바깥쪽으로 이동하여 막 탈분극에 반응하여 게이팅 전류를 생성한다는 전제를 뒷받침합니다6.
FSDF는 막 탈분극 또는 다른 자극에 반응하여 채널이 기능함에 따라 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 조작된 이온 채널 또는 기타 단백질의 특정 시스테인 잔기(즉, S4 α-나선)에 접합된 티올 반응성 염료의 형광 변화를 측정합니다10. 사실, FSDF는 원래 막전위 8,10의 변화에 반응하여 게이팅 전하가 이동할 때 채널의 주 전압 센서로 제안된 KV 채널의 S4 세그먼트가 이동하는지 여부를 조사하기 위해 개발되었습니다. 전압 개폐 이온 채널의 경우, FSDF는 채널 기능 측정과 동시에 4개의 VSD의 독립적인 구조적 재배열을 해결할 수 있습니다(주어진 시간에 하나의 VSD 추적). 실제로, 이러한 접근법을 사용하면, 개별적인 VSD가 채널 활성화 및 불활성화의 특정 양태에 차별적으로 관여하는 것으로 나타났다(12,27,28,29,30). 채널 기능에 대한 각 VSD의 기여도를 식별하는 것은 관련성이 높으며 채널 운영을 추가로 설명하고 잠재적으로 약물 개발을 위한 새로운 목표를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
이종 발현 시스템에서 FSDF의 사용은 환원주의적 관점에서 채널 기능에 대한 이해를 증진하는 데 매우 도움이 되었습니다10,23. 많은 환원주의적 접근 방식과 마찬가지로 장점이 있지만 한계도 있습니다. 예를 들어, 한 가지 주요 한계는 이종 시스템에서 채널 나노 환경의 부분적인 재구성입니다. 종종, 이온 채널은 수많은 부속 서브유닛 및 그 기능을 변형시키는 수많은 다른 단백질과 상호작용한다31. 원칙적으로, 상이한 채널 및 그들의 부속 서브유닛은 다수의 단백질 코딩 구축물 또는 폴리시스트로닉 플라스미드의 사용으로 이종 시스템에서 발현될 수 있지만, 이들의 본래 환경은 완전히 재구성될 수 없다30,32.
우리 그룹은 최근 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링(ECC)33,34의 초기 단계를 연구하기 위해 천연 해리 골격근 섬유에서 FSDF의 변형을 발표했습니다35,36. 처음으로, 이 접근법은 성인 분화 근섬유의 본래 환경에서 전압-개폐 L형Ca2+ 채널(CaV1.1, DHPR로도 알려짐)로부터 개별적인 S4 전압-센서들의 모션 트래킹을 허용하였다37. 이는 빠른 자극 유도 자가 전파 탈분극을 허용하는 세포의 전기적 활성, 생체 내 전기천공을 통해 cDNA 플라스미드를 발현하는 능력, 세포 내 채널의 자연적인 높은 발현 및 구획 조직, 고속 이미징 및 전기생리학적 기록 장치와의 호환성을 포함하여 이 세포 유형의 여러 특성을 고려하여 달성되었습니다. 이전에는 고속 라인 주사 공초점 현미경을 검출 장치(37)로서 사용하였다. 이제 신호 수집을 위해 광 다이오드를 사용하여 기술의 변형이 제시됩니다. 이 포토다이오드 기반 검출 시스템은 다른 실험실에서 이 기술의 구현을 용이하게 할 수 있습니다.
여기에서는 CaV1.1에서 개별 전압 센서 이동을 연구하기 위해 천연 셀에서 FSDF를 활용하는 단계별 프로토콜이 설명되어 있습니다. CaV1.1 채널이 이 원고 전체에서 예로 사용되었지만 이 기술은 다른 이온 채널, 수용체 또는 표면 단백질의 세포 외 접근 가능한 도메인에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, CaV1.1 채널에서 개별 전압 센서 운동의 연구를 위해 근섬유에서 FSDF를 수행하는 단계별 프로토콜이 설명됩니다. 이 기술에 결합된 단계의 수와 접근 방식의 다양성이 복잡해 보일 수 있지만 이러한 기술의 대부분은 종종 생물 물리학자/세포 생물학자 실험실에서 일상적으로 사용됩니다. 따라서 겉보기 복잡성은 주로 단일 통합 기술에서 모든 다양한 접근 방식의 조합에 있습니다. …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EGFP-CaV1.1(토끼) 야생형 플라스미드를 공유해 주신 J. Vergara 박사(University of California, Los Angeles)에게 감사드립니다. 트랙 앤 홀드 회로가 있는 포토다이오드의 설계 및 제작에 대해 Yale Department of Physiology Electronics Laboratory, 특히 Henrik Abildgaard에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 R01-AR075726 및 R01-NS103777의 지원을 받았다
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
Referenzen
- Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
- Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
- Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
- Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
- Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
- Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
- Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
- Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
- Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
- Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
- Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
- Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
- Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
- Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
- MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
- Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
- Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
- Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
- Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
- Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
- Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
- Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
- Beam, K. G., Horowicz, P. . Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , (2004).
- Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. . Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , 811-822 (2012).
- Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
- Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
- Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
- Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
- Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
- Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
- Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
- Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
- Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
- Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
- Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).
