Rétention moléculaire universelle avec microscopie à expansion 11 fois
Summary
Une nouvelle version de la microscopie à expansion (ExM), Magnify, modifiée pour une expansion allant jusqu’à 11 fois, conservant une gamme complète de classes de biomolécules et compatible avec un large éventail de types de tissus. Il permet d’interroger la configuration nanométrique de biomolécules à l’aide de microscopes conventionnels à diffraction limitée.
Abstract
L’imagerie à l’échelle nanométrique de spécimens biologiques peut améliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie. Au cours des dernières années, la microscopie à expansion (ExM) s’est avérée être une alternative efficace et peu coûteuse à la microscopie optique à superrésolution. Cependant, il a été limité par le besoin d’agents d’ancrage spécifiques et souvent personnalisés pour conserver différentes classes de biomolécules dans le gel et par les difficultés liées à l’expansion des formats d’échantillons cliniques standard, tels que les tissus incorporés dans la paraffine fixés au formol, en particulier si des facteurs d’expansion plus importants ou des épitopes de protéines préservés sont souhaités. Ici, nous décrivons Magnify, une nouvelle méthode ExM pour une expansion robuste jusqu’à 11 fois dans un large éventail de types de tissus. En utilisant la méthacroléine comme ancrage chimique entre le tissu et le gel, Magnify retient plusieurs biomolécules, telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques, dans le gel, permettant ainsi l’imagerie à grande échelle nanométrique des tissus sur des microscopes optiques conventionnels. Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour assurer une expansion tissulaire robuste et sans fissures, ainsi que des conseils pour la manipulation et l’imagerie des gels hautement expansés.
Introduction
Les systèmes biologiques présentent une hétérogénéité structurelle, des membres et des organes jusqu’aux niveaux de protéines à l’échelle nanométrique. Par conséquent, une compréhension complète du fonctionnement de ces systèmes nécessite un examen visuel à travers ces échelles de taille. Cependant, la limite de diffraction de la lumière pose des problèmes de visualisation de structures inférieures à ~200-300 nm sur un microscope à fluorescence conventionnel. En outre, les méthodes optiques de super-résolution 1,2,3, telles que la déplétion par émission stimulée (STED), la microscopie de localisation photoactivée (PALM), la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie à illumination structurée (SIM), bien que puissantes, présentent leurs propres défis, car elles nécessitent du matériel et des réactifs coûteux et ont souvent des temps d’acquisition lents et une faible capacité à imager de grands volumes en 3D.
La microscopieà expansion 4 (ExM) fournit un moyen alternatif de contourner la limite de diffraction de la lumière en ancrant de manière covalente les biomolécules dans un gel polymère gonflable à l’eau et en les séparant physiquement, les rendant ainsi résolvables sur des microscopes optiques conventionnels. Une multitude de variantes du protocole ExM ont été développées depuis la publication originale d’ExM il y a moins d’une décennie, et ces protocoles permettent l’incorporation directe des protéines 5,6,7, ARN 8,9,10, ou lipides11,12,13 dans le réseau de gel en modifiant l’ancrage chimique ou en élargissant davantage l’échantillon (améliorant ainsi la résolution effective) soit en une seule étape14, soit en plusieurs étapes itératives15,16. Jusqu’à récemment, aucun protocole ExM ne pouvait conserver ces trois classes de biomolécules avec un seul ancrage chimique disponible dans le commerce tout en fournissant un gel mécaniquement robuste qui pouvait se dilater ~10 fois en un seul cycle d’expansion.
Ici, nous présentons Magnify17, un ajout récent à l’arsenal ExM qui utilise la méthacroléine comme ancrage de la biomolécule. La méthacroléine forme des liaisons covalentes avec les tissus comme celui du paraformaldéhyde, assurant que plusieurs classes de biomolécules peuvent être retenues dans le réseau de gel sans nécessiter divers agents d’ancrage spécifiques ou personnalisés. De plus, cette technique peut élargir un large spectre de tissus jusqu’à 11 fois, y compris des échantillons notoirement difficiles tels que les échantillons cliniques fixés au formol (FFPE). Les méthodes précédentes pour étendre de tels échantillons mécaniquement rigides nécessitaient une digestion sévère de la protéase, rendant impossible le marquage des anticorps des protéines d’intérêt après l’expansion de l’échantillon. En revanche, cette technique permet d’étendre des échantillons cliniques FFPE à l’aide d’une solution dénaturante à chaud, préservant ainsi les épitopes de protéines entières dans le gel, qui peuvent être ciblés pour l’imagerie post-expansion (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons le protocoleMagnify 17, une variante ExM qui peut retenir plusieurs biomolécules avec une seule ancre chimique et multiplier par 11 les échantillons cliniques FFPE difficiles grâce à la dénaturation thermique. Les principaux changements apportés à ce protocole qui le distinguent des autres protocoles ExM comprennent l’utilisation d’un gel reformulé qui reste mécaniquement robuste même lorsqu’il est complètement expansé, ainsi que l’utilisation de méthacro…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Université Carnegie Mellon et la D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. et X.R.), les National Institutes of Health (N.I.H.) Prix du nouvel innovateur du réalisateur DP2 OD025926-01 et la Fondation Kauffman.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Referenzen
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