Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine Patch-Clamp verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf die Rückenmarkstimulation (SCS) mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit zu verbessern.

Zusammenfassung

Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Da die Motoneuronen die letzte Einheit sind, die sensomotorisches Verhalten ausführt, kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Reaktionen von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch noch einige komplexe Schwierigkeiten, um dieses Ziel zu erreichen, einschließlich der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, der schnellen Trennung des Rückenmarks von der knöchernen Struktur und der Verwendung des SCS zur erfolgreichen Induktion von Aktionspotenzialen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das Patch-Clamp verwendet, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks zu verbessern und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zelle aufrechtzuerhalten, um den elektrischen Mechanismus von SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.

Einleitung

Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Andreas Rowald et al. berichteten, dass SCS die Funktion des Bewegungsapparates und des Rumpfes der unteren Gliedmaßen innerhalb eines einzigen Tages ermöglicht¹. Die Erforschung des biologischen Mechanismus von SCS für die Erholung des Bewegungsapparates ist ein kritisches Forschungsfeld für die Entwicklung einer präziseren SCS-Strategie. Das Team um Grégoire Courtine zeigte beispielsweise, dass exzitatorische Vsx2-Interneuronen und Hoxa10-Neuronen im Rückenmark die Schlüsselneuronen für die Reaktion auf SCS sind, und dass ein....

Protokoll

Das Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte alle Tierversuche und die Studien wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Tierschutzbestimmungen durchgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Tiere
   1. Haltungsinformationen: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (postnatal 10-14 Tage, P10-P14) in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung.
      HINWEIS: Die Raumbedingungen wurden bei 20 °C ± 2 °C gehalten, Luftfeuchtigkeit: 50%-60%, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.
   2. Markierung der Motoneuronen retrograde: Injizieren Sie Fluor-Gold (FG....

Ergebnisse

Dank der rigorosen Tieftemperaturhaltung während des Feinbetriebs (ergänzende Abbildung 1, ergänzende Abbildung 2 und Abbildung 1) war die Lebensfähigkeit der Zellen gut genug, um nachfolgende elektrophysiologische Aufzeichnungen durchzuführen. Um das klinische Szenario so weit wie möglich zu simulieren, haben wir die SCS-Kathode und die Anode mittels Mikromanipulation in der Nähe der dorsalen Mittellinie bzw. der DREZ platziert (Abbildung 2), d.......

Diskussion

Die durch SCS modulierten Bewegungsinformationen werden schließlich zu den Motoneuronen konvergiert. Daher könnte die Verwendung der Motoneuronen als Forschungsziel das Studiendesign vereinfachen und den Neuromodulationsmechanismus des SCS direkter aufdecken. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch immer noch einige Schwierigkeiten, einschließl.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenosin 5'-triphosphat Magnesiumsalz	Sigma	A9187
Ascorbinsäure	Sigma	A4034
CaCl2· 2H2O	Sigma	C5080
Cholin Chloride	Sigma	C7527
Cover Slide Pinzette	VETUS	36A-SA	Clip a
slice D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Feinschere	RWD Life Science	S12006-10	Membran schneiden
Fluoreszenz-Lichtquelle	Olympus	U-HGLGPS
Fluor-Gold	Fluorochrom	Fluorochrom	Markierung des Motoneurons
Guanosin 5′-triphosphate sodium salt	hydrate Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
Infrarot CCD Kamera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-Gluconat	Sigma	P1847
Agarose Sigma		A9414
MgSO4· 7H2O	Sigma	M2773
Mikromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P1000
Mikroschere	Jinzhong	wa1020	Laminektomie-Mikroskop
für die Anatomie	Olympus	SZX10
Mikroskop für die Ekletrophysiologie	Olympus	BX51WI
Mikrozahnpinzette	RWD Life Science	F11008-09	Heben Sie den geschnittenen Wirbelkörper
an NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphokreatin	Sigma	P7936
Objektiv für die Ekletrophysiologie	Olympus	LUMPLFLN60XW	Arbeitsabstand 2 mm
Osmometer	Erweitert	FISKE 210
Patch-Clamp-Verstärker	Axon	Multiclamp 700B
Patch-Clamp Digitalisierer	Axon	Digidata 1550B
pH-Messgerät	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Mehrkanal-System	SHD-27H
Rückenmarkstimulator	PINS	T901
Zahnpinzette	RWD Life Science	F13030-10	Heben Sie das Xiphoid-Vibratom
	an Leica	VT1200S
Breitband-UV-Anregungsfilter	Olympus	U-MF2