悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング
Summary
私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。
Abstract
悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は、シュワン細胞またはその前駆細胞に由来する。腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)の患者では、MPNSTは最も一般的な悪性腫瘍であり、主要な死因です。これらのまれで侵攻性の軟部肉腫は、5年無病生存率が34〜60%であり、厳しい未来を提供します。MPNST患者の治療選択肢は残念なことに限られており、外観を損なう手術が最も重要な治療選択肢です。Rasシグナル伝達の阻害剤であるチピファルニブなど、かつては有望視されていた多くの治療法が臨床的に失敗しています。同様に、上皮成長因子(EFGR)を標的とするエルロチニブ、血管内皮増殖因子受容体(VEGF)、血小板由来成長因子受容体(PDGF)、およびRafを標的とするソラフェニブを標準化学療法と併用した第II相臨床試験でも、患者に反応を示すことができませんでした。
近年、がん細胞株の遺伝子プロファイリングと組み合わせた機能的ゲノムスクリーニング法は、必須の細胞質シグナル伝達経路の同定や標的特異的治療法の開発に有用であることが証明されています。稀な腫瘍型の場合、異種間比較腫瘍ゲノミクスとして知られるこのアプローチのバリエーションが、新規治療標的の同定にますます用いられている。異種間比較腫瘍ゲノミクスでは、遺伝子プロファイリングと機能ゲノミクスが遺伝子改変マウス(GEM)モデルで実施され、その結果が入手可能な希少なヒト検体および細胞株で検証されます。
この論文では、全エクソームシーケンシング(WES)を使用して、ヒトおよびマウスのMPNST細胞における候補ドライバー遺伝子変異を同定する方法について説明します。次に、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングを実施して、マウスおよびヒトMPNST細胞の重要なシグナル伝達経路を同定および比較し、これらの経路における創薬可能な標的を同定する方法について説明します。これらの方法論は、さまざまな種類のヒトがんにおける新しい治療標的を特定するための効果的なアプローチを提供します。
Introduction
悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は、腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)に関連して発生する非常に攻撃的な紡錘細胞腫瘍であり、一般集団および以前の放射線療法の部位で散発的に発生します1,2,3。NF1患者は、NF1腫瘍抑制遺伝子の野生型コピーと、機能喪失変異を有する第2のNF1対立遺伝子を持って生まれる。このハプロ不全の状態により、NF1患者は野生型NF1遺伝子の2回目の機能喪失変異の影響を受けやすくなり、腫瘍形成を引き起こします。この「セカンドヒット」NF1変異がシュワン細胞系統の細胞に発生すると、結果として生じる腫瘍は、皮膚に発生する真皮神経線維腫か、大神経または神経叢に発生する網状神経線維腫のいずれかである。皮膚神経線維腫と網状神経線維腫の病理は同じですが、それらの生物学的挙動はまったく異なります-真皮神経線維腫と網状神経線維腫はどちらも良性ですが、網状神経線維腫のみが形質転換を受け、MPNSTを引き起こす可能性があります。NF1遺伝子によってコードされるRas GTPase活性化タンパク質であるニューロフィブロミンの喪失に加えて、MPNSTは、TP53 4,5,6,7、CDKN2A 8,9、およびPTEN 10、ポリコーム抑制複合体の構成要素をコードする遺伝子の変異を含む、他の複数の腫瘍抑制遺伝子の変異を運びます2 11,12 (PRC2; SUZ12およびEED遺伝子)および受容体チロシンキナーゼの異常な発現1,2。NF1および上記の他の遺伝子の変異は、散発性および放射線誘発性MPNSTにも存在する11,12。
MPNSTのゲノム異常の理解におけるこれらの進歩は、その病因を理解する上で非常に貴重ですが、MPNSTの効果的な新しい治療法の開発にはまだ至っていません。新しい治療法の開発を妨げる大きな障壁は、MPNSTがまれながんであるという事実です。このため、The Cancer Genome Atlas(TCGA)で実施されているような主要なドライバー変異を定義する全体的な解析に必要な多数の患者サンプルを入手することは困難です。私たちの経験では、適度な数のヒトMPNST標本を蓄積するだけでも何年もかかることがあります。このような限界を克服するために、他の希少がん種を研究する多くの研究者は、種間比較腫瘍ゲノミクスを使用して、必須のドライバー遺伝子変異を同定し、目的の腫瘍に必須の細胞質シグナル伝達経路を定義し、新しい治療標的を特定しています。腫瘍形成に不可欠なシグナル伝達経路は、ヒトと他の脊椎動物種の間で高度に保存されているため、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングなどの機能ゲノミクスアプローチを適用することは、これらの新しいドライバー変異、シグナル伝達経路、および治療標的を特定するための効果的な手段となり得ます13,14,15,16,17,18,19、特に限られた数で入手可能なまれなヒト腫瘍タイプを研究する場合20.
ここで紹介する方法論では、成長因子ニューレグリン-1(NRG1)のシュワン細胞特異的な過剰発現が叢状神経線維腫の病因とその後のMPNSTへの進行を促進する遺伝子改変マウスモデル(GEM)であるP0-GGFβ3マウスに由来するヒトMPNST細胞株および早期継代MPNST培養においてゲノムプロファイリングを実施するためのこのアプローチについて説明します21。22,23。このアプローチの最初のステップは、P 0-GGFβ3 MPNST、ヒトMPNST細胞株、および外科的に切除されたヒトMPNSTの候補ドライバー遺伝子を同定することです。次に、これらの変異の影響を受けるシグナル伝達経路を機能的に検証するために、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングを使用して、ヒトおよびマウスのMPNST細胞株における増殖と生存に必要な遺伝子を同定します。増殖と生存に必要な遺伝子を同定した後、Drug Gene Interaction Databaseを用いて「ヒット」の集合体の中から創薬可能な遺伝子産物を同定します。また、ヒトとマウスのMPNST細胞の「ヒット」を比較して、GEMモデルとヒトMPNSTが同じ遺伝子とシグナル伝達経路に同様の依存性を示すかどうかを判断します。増殖と生存に必要な遺伝子の重複と、影響を受けるシグナル伝達経路を同定することは、P 0-GGFβ3マウスモデルを分子レベルで検証する手段として役立ちます。また、このアプローチでは、ヒトとマウスのスクリーニングを組み合わせて新しい治療標的を同定することの有効性も強調されており、マウスモデルはヒトのスクリーニングを補完する役割を果たすことができます。この異種間アプローチの価値は、ヒト腫瘍や細胞株の入手が困難な希少腫瘍の治療標的を探す場合に特に顕著です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する詳細な方法は、末梢神経系腫瘍とMPNSTの病因を研究するために開発されました。これらの方法は効果的であることがわかりましたが、ここで説明する方法にはいくつかの潜在的な制限があることを認識する必要があります。以下では、これらの制限のいくつかと、他のモデルシステムでそれらを克服するための潜在的な戦略について説明します。
我々は、…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353およびR01 NS109655 to S.L.C.;R01 NS109655-03S1 から D.P.J.)、国立がん研究所 (R01 CA122804 から S.L.C.)、および国防総省 (X81XWH-09-1-0086 および W81XWH-12-1-0164 から S.L.C. へ)。
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
Referenzen
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